循环肿瘤DNA在胃癌诊断中的临床应用

杨克西 陈卫昌

苏州大学附属第一医院消化内科(215008)

胃癌是全球第5大高发癌症，亦是第3大癌症死亡原因[1]。在中国，胃癌的发病率和死亡率均位列第2位，仅次于肺癌。胃癌的常规治疗包括手术切除和辅助治疗等。目前许多国家还未普及胃癌筛查，超过50%的患者早期症状不典型，诊断时已处于晚期，往往已有腹膜转移或远处转移。近年来，虽然早期胃癌检出率有所提高，手术方法有所改进，但患者生存率亦不理想。

当前胃癌诊治难点主要存在以下几个方面：①早期难以发现；②组织活检为有创检查，难以反复获取，且肿瘤内有异质性；③现有肿瘤标志物敏感性和特异性不高；④个体差异较大；⑤受检查手段(CT或MRI)限制不能实时对治疗效果进行检测。研究者不断探索更敏感的检测手段来检测胃癌的发生、发展，除通过蛋白质组学技术研究血清肿瘤标志物外，目前还引入了循环肿瘤DNA的概念，液体活检作为新兴技术得到了蓬勃发展。液体活检指通过以微创或非侵入性的方式获得血液或其他体液的取样来分析肿瘤(如细胞或核酸)，主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、外泌体(exosome)、微 RNA(microRNA，miRNA)等的检测。ctDNA作为液体活检的生物学标志物之一，与传统诊断手段相比，具有诸多优势。本文就ctDNA在胃癌诊断中的临床应用作一综述，旨在说明该指标在诊断、指导、监测治疗、预后评估等方面的优劣性。

一、ctDNA的生物学特性

Mandel等[2]于1948年首次描述了人类血液中无细胞核酸片段的存在。1977年Leon等[3]首次报道了癌症患者血清ctDNA浓度升高。但此变化亦可见于其他生理或病理情况，如运动[4]和急性颅脑外伤[5]。1989年Stroun等[6]的研究发现，癌症患者部分血浆ctDNA来自于癌细胞。1991年Sidransky等[7]的研究发现，来自浸润性膀胱癌患者尿沉渣中的DNA携带p53基因突变。之后，与结直肠癌、胰腺癌或肺癌的突变相匹配的KRAS突变相继在粪便或痰液中被发现。1994年首次发现在患者血浆无细胞DNA(cfDNA)中的KRAS突变序列，证实血浆中的突变DNA片段来源于肿瘤[8]。健康受试者的血液cfDNA水平为0～100 ng/mL，平均为30 ng/mL，而在癌症患者中为0～1 000 ng/mL，平均为180 ng/mL[9]。在癌症患者中，ctDNA只占cfDNA总量的一小部分，此比例取决于肿瘤负担、癌症分期、细胞代谢以及对治疗的反应[10]。据估计，患者的实体肿瘤重量每100 g(约3×1010个肿瘤细胞)将释放3.3%的肿瘤DNA至循环[11]。除血液外，在多种体液中均可检测到ctDNA，包括腹水、母乳、淋巴和腹膜液、骨髓抽吸液、尿液、前列腺液、腹腔灌洗液、痰液、脑脊液、胃液、胆汁和粪便[12]。

二、ctDNA的分析方法

从理论上讲，所有可检测基因组信息的手段均可检测ctDNA，但肿瘤患者血液中ctDNA含量极低，不易检测，因此需敏感性和特异性均较高的检测方法。对于已知致癌突变位点的检测，一般采用数字PCR(digital PCR, dPCR)、微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、BEAMing技术(beads， emulsion， amplification， magnetics)等。而下一代测序(next generation sequencing, NGS)技术因其通量和智能程度高，可在短时间内完成对上百亿碱基对的测序，显著提高了ctDNA的检测水平。同时，正在发展的还有“第3代”全基因组测序技术，其在癌症患者精准管理中有良好的应用前景。

三、ctDNA在胃癌中的应用

1. 诊断：目前，ctDNA检测为胃癌的诊断提供了新思路。多项研究发现肿瘤患者和健康人群血浆ctDNA水平存在显著差异。Kim等[13]的研究发现，胃癌患者血浆cfDNA水平高于健康人群，且晚期(Ⅲ期/Ⅳ期)患者血浆cfDNA 水平显著高于早期胃癌患者。Park等[14]对54例胃癌患者血浆cfDNA水平进行研究，结果显示胃癌患者较同年龄健康对照者升高2.4倍。

与其他血清肿瘤标志物相比，ctDNA在诊断方面亦显示出独有优势。Sun等[15]的研究发现，SEPT9对结直肠癌诊断和复发监测的敏感性和特异性均高于癌胚抗原(CEA)、糖链抗原19-9(CA19-9)和CA72-4。Berger等[16]发现CA19-9和血小板反应蛋白2(THBS2)诊断胰腺癌的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.80和0.73, CA19-9联合THBS2的AUC提高至0.87，当两者结合ctDNA时，AUC进一步升至0.94，提示ctDNA在协同诊断中发挥一定作用。虽然ctDNA在诊断方面具有显著优势，但尚未发现胃癌特异性ctDNA。

2. 指导用药、监测治疗效果：在过去20年内，靶向治疗发展迅速，已广泛应用于多种肿瘤中。根据患者个体间的差异进行个体化治疗是当下医学发展的核心，而克服肿瘤异质性是胃癌个体化治疗的主要挑战，尤其是针对人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的靶向治疗。Liu等[17]采用ddPCR检测胃癌患者血浆与福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品中HER2扩增的符合率为81.4%，敏感性为76.5%，特异性为83.8%。治疗2个月后血浆HER2/延伸因子Tu GTP结合域2(EFTUD2)比值显著降低。随访期间7例患者疾病出现进展，其中4例死亡。中位无进展生存期为9.8个月。Wang等[18]的研究发现，ctDNA中HER2拷贝数变化可有效监测曲妥珠单抗的疗效，其效应优于常用的CEA和CA19-9，提示HER2在临床中具有潜在的应用价值。

靶向治疗在应用过程中会逐渐失去作用，ctDNA可帮助监测病情变化，查明耐药原因。克唑替尼是一种间质表皮转化因子(mesenchymal to epithelial transition factor, MET)抑制剂，已证实其对 MET扩增的胃癌有效。Lennerz等[19]的研究发现，4例经克唑替尼治疗的MET扩增肿瘤中2例肿瘤缩小，但分别在3.7个月和3.5个月后进展。另一项研究[20]通过ctDNA分析1例晚期胃癌(Ⅳ期)患者接受克唑替尼治疗2个月后发生耐药的分子机制，结果发现MET扩增再发生、多个继发性MET突变、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)基因相对拷贝数的急剧增加以及其他下游和旁路元件突变，上述变化可能与患者的癌症进展有关，亦是导致MET抑制剂无效的原因。

3. 复发的监测和预后的判断：诸多研究对cfDNA水平在胃癌手术切除后的临床价值进行探讨。Pu等[21]的一项纵向研究发现，ctDNA在术前和术后第21天升高，但在术后3个月下降，如疾病有进展则再次升高。Lan等[22]对428例胃癌患者的一项大型研究发现，手术切除后持续高ctDNA水平是胃癌复发的指标。一项针对277例Ⅳ期胃癌患者的研究[23]发现，对术前存在较高水平ctDNA突变的患者，5年随访期内复发的风险增加，总体生存率降低。

多项研究评估了cfDNA拷贝数与预后的关系。Shoda等[24]对61例Ⅰ、Ⅱ期胃癌手术切除患者的研究发现，术后ctDNA的HER2/核糖核酸酶P RNA组分H1(RPPH1)比值随复发而增加。另一项研究[25]探讨了EB病毒(EBV)DNA在153例胃癌切除患者中的诊断价值。在21例EBV相关性胃癌患者中，通过循环EBV DNA水平评估了9例术后ctDNA缺失患者的临床特征，其中1例随访2年以上者的EBV ctDNA升高早于临床确诊的复发。

目前评估DNA突变对胃癌预后影响的研究较少。Fang等[26]对277例进展期胃癌患者的8个基因(共68个突变)进行研究，结果证实晚期胃癌患者ctDNA水平升高与腹膜复发和预后不良有关，晚期胃癌患者ctDNA突变与预后不良有关。一项研究[27]对42例接受手术切除的Ⅱ期胃癌患者进行纵向研究，评估TP53突变浓度，结果发现ctDNA含量变化与患者病情一致，即术后ctDNA含量下降，复发者ctDNA含量增加。

表观遗传学改变是胃癌发生的重要事件之一，包括组蛋白修饰、甲基化等。两项研究[28-29]分别探讨了ctDNA生物学标志物MINT2启动子和组织金属蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)对92例胃癌手术切除患者无进展生存期和复发风险的评估价值，结果显示术前ctDNA中MINT2启动子甲基化异常与腹膜播散和肿瘤进展有关；TIMP-3甲基化与无病生存率下降相关。Pimson等[30]的研究显示，101例晚期胃癌患者中，PCDH10和RASSF1A甲基化率分别为94.1%和83.2%，此甲基化异常可导致患者的中位生存期降至8个月。Balgkouranidou等[31]的研究发现，73例可手术胃癌患者术前ctDNA中，SOX17甲基化可降低患者总体生存率(overall survival, OS)。目前缺乏对ctDNA评估胃癌预后的深入研究，亦无研究表明ctDNA是一个独立的复发预测因子，甲基化RASSF1A和SOX有望成为独立的预测OS的指标。由于越来越多的研究关注ctDNA在肿瘤预后方面的价值，Yang等[32]提出了肿瘤TNMB分期系统，较之于TNM分期系统，该系统增加了液体活检的评估，使患者的癌症诊断、治疗和预后评价更准确。

四、局限性

ctDNA作为液体活检的重要组成部分，在胃癌个体化诊疗的各个方面发挥越来越重要的作用，但其发展过程仍然面临诸多问题。①ctDNA检测手段很多，但缺乏金标准；②现有ctDNA检测技术价格高昂，需改进技术的同时降低成本；③需行前瞻性研究，并在大规模后续研究中验证结果，以确保临床适用性。

人群种族多样性有限是目前胃癌ctDNA研究的重要局限，ctDNA的数据均来自于亚洲患者群体。由于种族差异会影响肿瘤的发生和遗传背景[33]，因此亚洲患者数据集应用于其他种族背景的患者需谨慎。

美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理医师学会对已发表的ctDNA研究进行综述，证实ctDNA检测方法在某些类型晚期癌症中有较好的临床有效性和实用性，但并不适用于所有肿瘤。已证实ctDNA结果与肿瘤组织基因分型存在不一致，因ctDNA可能会遗漏，故目前更支持肿瘤组织基因分型的结果。尚无充足证据表明ctDNA在早期诊断、治疗监测或残留疾病检测以及癌症筛查中的临床有效性[34]。

五、总结和展望

总之，液体活检因方便、快捷、实时等特点在肿瘤学中占据越来越重要的位置。ctDNA与肿瘤具有千丝万缕的联系，NGS技术的发展可加快对ctDNA的理解和认识。在诊断方面，ctDNA已被证实可作为新型肿瘤标志物用于诊断肿瘤。然而，与其他肿瘤如结直肠癌、肺癌相比，其在胃癌中的研究时日尚短，尚未发现特异性ctDNA。同时应将ctDNA与胃癌的标志物进行对比，证实其可靠性。在指导用药和监测疗效方面，HER2扩增扮演了重要角色，但期望更多研究能提示ctDNA与肿瘤分子耐药机制间的关系，从而给临床提供更多选择和思考；最后，在预后方面，尚未证实ctDNA可作为判断预后的独立因素。除甲基化外，仍需对ctDNA浓度、数量、突变等行更大样本量研究。此外，目前尚缺乏ctDNA与胃癌组织类型、解剖学分类关系的研究。对ctDNA的探索尤其在胃癌中的研究仍处于初级阶段，未来需行进一步研究探讨其诊断、评估疗效、预后的作用。