中性粒细胞胞外捕网、血小板和肿瘤的关系

许张轩， 李虹萱， 吴清云， 邹小明

哈尔滨医科大学附属第二医院胃肠外科，黑龙江 哈尔滨 150086

细胞核或线粒体来源的DNA外显化之后，与组蛋白和颗粒蛋白酶[如中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和过氧化物酶(MPO)]结合形成中性粒细胞胞外捕网(NETs)。NETs有助于中性粒细胞捕获和杀死病原体，如细菌、病毒和真菌。目前的研究[1-2]认为，在癌症和自身免疫等无菌条件下，同样可以形成NETs并导致静脉血栓形成。最新的文献显示，血小板对NETs的形成与否有重要的影响[3-7]。本文将重点介绍在感染和无菌条件下，我们目前对血小板作为NETs形成调节因子的作用的认识。

1 促凝肿瘤微环境

由于肿瘤可诱导血小板活化，活化的血小板刺激肿瘤细胞或肿瘤微环境中的正常细胞分泌大量的血栓因子，此时凝血系统被激活，因此癌症患者出现静脉血栓疾病的风险大大增加[3-4]。活化后的血小板除了促进血栓因子生成，还能以多种方式促进肿瘤的进展[5-6]。血小板α-颗粒携带大量的生长因子，如PDGF、VEGF和TGF-β，这些因子在血小板活化后被释放，在创伤条件下有助于损伤部位的创面愈合和组织再生。然而，在肿瘤微环境中，这些生长因子却有利于肿瘤增殖、血管生成和侵袭能力增加，从而促进肿瘤的进展。此外，血小板还能通过不同的机制促进肿瘤转移[7]。例如血小板可以保护肿瘤细胞免受循环中的免疫识别和剪切力，有助于肿瘤细胞的黏附，帮助肿瘤细胞通过血管壁[8]。最新的文献显示，肿瘤细胞与血小板直接接触，诱导的NF-κB依赖性信号路径和血小板源性TGF-β产生协同作用，促进肿瘤细胞上皮—间充质样转化(EMT)[9]。EMT是侵袭能力的标志，是癌上皮细胞转移到远处器官的先决条件。

在生理条件下，为维持血管壁的完整性，血管内凝血途径不被激活。然而，肿瘤患者内皮下血小板激活因子如组织因子(TF)和胶原蛋白的暴露，刺激肿瘤局部的血小板活化，引起血管通透性增加，从而启动内源性凝血途径。同时，癌细胞也不断产生和分泌促凝因子，刺激肿瘤微环境甚至全身系统的血小板活化和血栓形成。TF由肿瘤细胞分泌，并在肿瘤细胞表面表达，与肿瘤的进展和血栓形成密切相关。例如，肿瘤组织中TF的表达升高与胰腺癌患者预后不良有关[10]。肿瘤细胞还可以分泌含TF的微粒(MPS)[11]。这些微粒与癌症患者的血栓前状态有密切关系[12-16]。除TF外，恶性肿瘤细胞还能分泌一种癌促凝物(CP)，它能激活与TF无关的外源性凝血途径[1]。在实体肿瘤和血液疾病中均能检测到CP，但在健康组织中未见其表达。许多研究表明，恶性肿瘤的进展与CP在不同类型癌症中的表达有关[1]。另外，肿瘤微环境中乙酰肝素酶、基质金属蛋白酶(MMPs)和血管内皮生长因子(VEGF)等，可进一步促进肿瘤的血栓形成[4]。乙酰肝素酶通过增强TF活性促进凝血[2]，MMP-2可与活化血小板中的β受体结合，促进血小板聚集[17-18]。肿瘤细胞中VEGF表达升高，可引起肿瘤血管通透性增加，导致上述血栓因子分泌升高。此外，VEGF作为天然免疫细胞(如中性粒细胞和单核细胞)的趋化剂，在肿瘤微环境中也有助于凝血[19]。传统上认为，止血和炎症是互不干涉的两个过程，但最新的研究表明它们是密切相关的[20]。例如，中性粒细胞可导致免疫血栓形成，因此对血栓形成疾病有重要的影响。近年来的研究发现，NETs有激活血小板和促进深静脉血栓形成(DVT)的作用[21-23]。

2 NETs

中性粒细胞占人类白细胞总量的60%～70%。中性粒细胞是先天免疫系统的重要组成部分，它通过吞噬微生物和分泌抗微生物肽，保护宿主免受致病菌的侵袭[24]。NETs可导致局部蛋白酶浓度增加，帮助中性粒细胞捕获和杀死病原体，如细菌、病毒和真菌[25-29]。除了微生物或脂多糖(LPS)等物质的刺激可产生NETs外，在血栓形成、癌症和自身免疫等无菌条件下也可生成NETs[30-31]。从第1篇关于肿瘤诱导的NETs形成的研究发表之后[32]，越来越多的研究结果显示，NETs和肿瘤是密切相关的。研究表明，癌症小鼠中性粒细胞较健康供者中性粒细胞更易形成NETs，且癌症小鼠中性粒细胞还与肺血栓形成有关。NETs还会在癌症小鼠的外周循环中积累，引起全身炎症反应，并在原发或转移性肿瘤生长的器官中显著降低其血管功能[33]。最近的一项研究表明，NETs的形成与癌症相关的肾功能不全密切相关[34]。

不仅如此，NETs还与癌症相关的血栓形成有关，未来或可以通过阻止NETs形成而预防癌症患者血栓形成[35]。NETs具有激活和聚集血小板的能力，这可能是其含有较高的核酸和组蛋白的原因[23]。由于NETs可以与内源性凝血途径的诱导因子Ⅻ结合并激活，所以NETs是DVT过程中不可缺少的因素[25]。而炎症和血栓形成之间的关系也可能与NETs有关。

尽管NETs有助于控制感染，但NETs的形成也会造成组织损伤[36]。胞外组蛋白在1987年已被证明可以介导组织损伤[37]，此后一直被认为是细胞毒性的主要诱导剂。组蛋白在脓毒症小鼠内皮功能障碍、器官衰竭和死亡中起重要作用[38]。体外实验表明，组蛋白对内皮细胞有直接损伤作用。最近发现，NETs不仅对内皮细胞有细胞毒性，对肺上皮细胞也有毒性[36]。同样的研究[37]表明，不仅组蛋白介导了NETs对内皮细胞和上皮细胞的细胞毒性作用，NETs分泌的MPO也参与了这一过程。

NETs可由不同的机制形成，它既可以通过一种中性粒细胞溶解的自杀机制，也可以通过另一种机制使中性粒细胞存活并执行其他免疫功能[39]。另外，NETs中已被证实存在核DNA和线粒体DNA[40-42]。这两种机制的共同模式是线粒体DNA快速外显化，中性粒细胞裂解并释放其核DNA成分[43]。显然，对于NETs形成的机制，还有很大的研究空间值得我们进一步探索。

3 感染或无菌条件下血小板对NETs形成的影响

如上所述，NETs是血小板活化和血栓形成的基本支架。同时，活化的血小板可以提供促进NETs形成的信号，并维持其自身活化状态。当LPS浓度达到足够水平时，LPS与血小板膜上的Toll样受体4(TLR4)结合，诱导中性粒细胞活化和NETs形成[44]。这一机制与“NETs形成是免疫系统控制感染的最后手段”的观点相符，因为NETs的形成也会导致组织损伤[45]。除了LPS外，三酰脂肽(Pam3CSK4)也可诱导血小板促进NETs形成，Pam3CSK4作为TLR1和TLR2的激动剂，是模拟细菌LPS的酰化氨基端[46]。类似地，针对病毒入侵，血小板和中性粒细胞也相互作用并促进NETs形成。 在一项活病毒感染小鼠模型的研究中发现，CD41(整合素αⅡb亚单位)与NETs形成有关。正常病毒感染小鼠体内，血小板和中性粒细胞在肝脏脉管系统内相互作用形成NETs。当对缺乏CD41的小鼠进行相同的处理(感染活病毒)时，肝脏中未观察到血小板聚集，NETs也未形成[45]。

除了微生物刺激与TLRs相互作用的情况外，在无菌条件下血小板也可促进NETs的形成。在输血相关性急性肺损伤(TRALI)小鼠模型中，输血后导致小鼠死亡的主要原因是活化的血小板诱导NETs的形成[47]。在该模型中，NETs可能参与了肺内皮细胞的损伤。此外，在TRALI患者的肺和血浆中也发现了NETs。在TRALI小鼠模型中，以阿司匹林或替罗非班(血小板—纤维蛋白原抑制剂)靶向抑制血小板激活，发现NETs的形成减少，肺损伤减轻。这些数据表明，由胶原、凝血酶或ADP等经典激动剂激活的血小板可促进NETs的形成。

研究表明，凝血酶激活的血小板可诱导NETs形成[48]。P-选择素敲除小鼠的凝血酶激活的血小板未形成NETs，表明血小板颗粒活化后释放的可溶性介质并不能有效地诱导NETs的形成。因此，血小板P-选择素与P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)在中性粒细胞表面的相互作用是必不可少的前提条件。

在小鼠肾缺血-再灌注(I/R)损伤模型中，肾组织中有NETs形成[49]。用氯吡格雷(血小板抑制剂)治疗小鼠后，可降低I/R诱导的小鼠NETs形成和组织损伤，这进一步显示了血小板在NETs形成中的作用。

血小板依赖性NETs形成在急性肺损伤小鼠模型中也得到了证实[50]。在该肺损伤模型中，证实血小板依赖性NETs形成需要通过血小板趋化因子刺激中性粒细胞，并通过整合素β2进行信号传导。此外，研究发现，血小板膜糖蛋白GpIb也与血小板依赖性NETs形成有关[45]。事实上，血管性血友病因子(vWF)被认为是血小板GpIb和中性粒细胞PSGL-1之间的桥梁，阻断这三者之一即可阻止血小板诱导NETs的形成。

研究发现，高迁移率族蛋白1(HMGB1)可激活血小板，诱导中性粒细胞形成NETs[51-52]。HMGB1除了在血小板中储存和释放以外，其他类型的免疫细胞也可分泌HMGB1。但HMGB1缺乏的血小板在激活后则不能诱导NETs形成[53]。该研究认为，晚期糖基化终产物受体(RAGE)与HMGB1结合，激活中性粒细胞促进NETs形成。有争议的是，另一项研究提出，HMGB1通过与中性粒细胞上的TLR4相互作用诱导NETs形成[51]。此外，微生物刺激后从血小板释放的β-防御素也可诱导NETs形成[54]。趋化因子CXCL4在体外[46]和体内[50]均与NETs形成有关。有研究表明，利用短肽抑制CXCL4和CCL5异二聚化，可减少急性肺损伤模型小鼠的NETs形成[50]。

活化的血小板在肿瘤诱导的NETs形成中是否也有作用,这个问题值得进一步探讨。然而，考虑到已经证明经典的血小板激动剂(例如凝血酶)可促进血小板依赖性NETs形成，这种情况并非不可能。另外，肿瘤可通过TF的表达升高和产生凝血酶等机制促进血小板过度活化。P-选择蛋白和纤维蛋白原受体不仅参与了血小板诱导的NETs形成，并在促血栓性肿瘤微环境激活的血小板上表达升高。最近还提出了血小板活化肿瘤细胞促进NETs形成的另一种机制[54]。该研究表明，血小板是肿瘤来源的外泌体的载体，进而促进NETs形成。

血小板TLR4在LPS诱导的NETs形成中起着重要的调节作用[44]。这可能是LPS以外的其他因素通过血小板TLR4信号途径诱导NETs形成。有研究提出，可能是一种纤连蛋白的剪接变体—额外结构域-A(ED-A)，与血小板上的TLR4结合[55]，诱导NETs形成。有趣的是，血小板上ED-A与TLR4的结合与血小板聚集和动脉血栓形成有关[56]，但这种相互作用与NETs形成的机制之间的关系仍有待研究。

综上所述，越来越多的证据表明，血小板在NETs的形成中起着重要的调节作用。这对于人体来说可能是一个重要的调节点，以确保在没有必要的情况下，对组织有细胞毒性的NETs不会形成。然而，在出现脓毒症的情况下，形成NETs以消除感染可能仍是对人体最有利的选择。 NETs也是肿瘤生长和其他炎症反应的结果，此时，NETs可能更多地作为细胞因子环境的不良反应而对人体有害。因此，未来我们应致力于了解哪些因素可诱导NETs形成，以便在负面影响超过正面的情况下干涉它们，从而使人体获益最大。