LBC联合BRAFV600E 基因检测在甲状腺乳头状癌诊断中的应用价值△

赵清泉，程思贤，许建华，郑正荣

福建医科大学附属第二医院甲乳外科，福建泉州 362000

甲状腺结节是临床中常见疾病，全球发病率约4%～7%，其中4%～8%的甲状腺结节为甲状腺癌，甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤[1]，也是近年来中国发病率增长最快的恶性肿瘤之一，其病理类型中的60%为甲状腺乳头状癌[2]。超声引导下对甲状腺结节行细针穿刺细胞学检查（fine needle aspiration cytology，FNAC）是临床诊断甲状腺癌的首选方案，通常采用传统涂片（coventional smear，CS）诊断甲状腺结节[1]。但CS的涂片质量较差，10%～40%的甲状腺结节无法明确诊断及判别[3]。当FNAC中选用液基细胞学（liquid-based cytology，LBC）技术制片，涂片质量更优，目前在临床上也较为广泛地使用。B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）最常见的突变是第600位密码子突变（V600E），BRAFV600E基因突变也是甲状腺癌常见的基因突变类型，在甲状腺乳头状癌中占29%～84%，且与甲状腺癌的侵袭程度密切相关[3]。有研究显示，BRAFV600E基因突变检测在甲状腺癌实体瘤临床诊断、良恶性鉴别诊断、预后评估方面有重要指导作用[4]。然而，目前临床关于LBC联合BRAFV600E基因突变鉴别诊断甲状腺结节良恶性的报道较少。因此，本研究采用LBC及BRAFV600E对甲状腺乳头状癌及良性病变进行鉴别诊断，旨在提高临床诊断甲状腺乳头状癌的准确性，为临床诊治提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年12月至2017年11月福建医科大学附属第二医院已进行手术治疗的90例甲状腺结节患者。纳入标准：术前均行CS、LBC和BRAFV600E检测，并且已经手术切除甲状腺结节的患者。排除标准：术后病理结果显示为非乳头状癌的甲状腺恶性肿瘤患者。90例甲状腺结节患者中，男性11例，女性79例，年龄13～67岁，平均（44.72±9.69）岁；肿物直径 5.0～75.0 mm，平均（29.4±10.7）mm；病程1天～20年；28例为单发结节，62例为多发结节；超声TI-RADS 4A～5类为58例，超声TI-RADS 2～3类为32例。

1.2 检测方法

所有患者术前均先行CS和LBC检测，并同时行实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRTPCR）法进行BRAFV600E基因检测。

患者取仰卧位，肩部垫软枕，头后仰，常规碘伏消毒铺巾，穿刺进针点局部浸润麻醉后，右手持一次性吸引活检针，超声引导下将细针穿入目标结节，拔出针芯，穿刺针在结节内沿不同方向前后快速穿插数次，通过虹吸原理吸取甲状腺结节细胞，囊实性结节穿取实性部位细胞，穿刺标本分别立即行CS、LBC和BRAFV600E基因检测。穿刺标本行CS后采用95%无水乙醇湿法固定，苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色[5]，德国莱卡光学显微镜下行细胞学诊断。

穿刺标本直接注入30 ml细胞保存液中，离心后去上清液，去除胶质、黏液和血细胞成分，利用全自动液基细胞制片仪制片、封片和HE染色，德国莱卡光学显微镜下行细胞学诊断。

穿刺标本注入含800 μl RNA later保存液的PCR管中以进行BRAFV600E基因检测。采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行DNA分离，提取样本基因组DNA，然后通过qRT-PCR进行基因扩增，采用扩增阻滞突变系统法和BRAFV600E基因突变试剂盒进行BRAFV600E基因检测。

1.3 诊断标准

所有患者检测后均行手术治疗，手术中切除的甲状腺结节标本均行组织病理学诊断，以组织病理学诊断结果为金标准。分析CS、LBC及BRAFV600E基因单独检测及LBC与BRAFV600E联合检测对甲状腺乳头状癌的诊断价值。根据甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统定义、标准和注释[6]，将甲状腺细胞病理学诊断分为6类：Thyl，标本无法诊断或不满意；Thy2，良性，包括结节性甲状腺肿、甲状腺增生、甲状腺炎；Thy3，意义不明确的细胞非典型性病变，或意义不明确的滤泡性病变；Thy4，滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤；Thy5，可疑恶性肿瘤；Thy6，恶性肿瘤。本研究将Thy2、Thy3和Thy4良性病变记为阴性，将Thy5、Thy6甲状腺乳头状癌记为阳性。BRAFV600E突变型为阳性，BRAFV600E野生型为阴性。双盲，由两名高年资病理科医师对病理学检测结果进行判定。灵敏度=真阳性例数（/真阳性+假阴性）例数×100%，特异度=真阴性例数（/真阴性+假阳性）例数×100%，准确度=（真阳性+真阴性）例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用描述性统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示；计数资料以例数和率（%）表示。

2 结果

2.1 LBC与CS 检测的甲状腺细胞病理学特点

90例患者，术后病理诊断结果显示40例患者为甲状腺乳头状癌，50例为良性病变（10例合并桥本甲状腺炎）。

显微镜下，CS背景较为模糊，血液、胶质及无定形物成分较多，滤泡细胞分布不集中、重叠堆积、出现多层排列现象，核沟、假包涵体、沙砾体等甲状腺乳头状癌的特征性诊断结构模糊难辨，制片过程中导致细胞变形及退变（图1）。显微镜下，LBC视野更加清晰，血液、胶质成分少，滤泡细胞集中且数量显著增加，细胞呈单层小簇状排列，恶性细胞以散在或拥挤的三维细胞团排列，视觉立体感增强，细胞核清晰，核仁易识别（图2、图3）。

2.2 CS、LBC、BRAFV600E 基因检测单独或联合检测对甲状腺乳头状癌的诊断价值

CS检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为72.50%（29/40）、96.00%（48/50）、85.56%（77/90）；LBC检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为85.00%（34/40）、98.00%（49/50）、92.22%（83/90）；BRAFV600E基因检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为67.50%（27/40）、100%（50/50）、85.56%（77/90）；LBC联合BRAFV600E基因检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为95.00%（38/40）、98.00%（49/50）、96.67%（87/90）。（表1、表2）

图1 CS 检测甲状腺乳头状癌病理活检结果（HE染色，×200）

图2 LBC 检测甲状腺乳头状癌病理活检结果（HE染色，×200）

图3 LBC 显示甲状腺细胞核内包涵体（HE染色，×400）

表1 CS和LBC单独检测甲状腺乳头状癌的结果与病理诊断结果的对照

表2 BRAF V600E基因单独检测及LBC联合BRAF V600E基因检测甲状腺乳头状癌的结果与病理诊断结果的对照

3 讨论

目前，FNAC在国外已成为评估甲状腺结节性质的常规检查手段，临床应用呈现逐年递增趋势[7]。王丹[8]研究分析甲状腺结节FNAC诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断准确度分别为96.67%、89.74%、87.8%、92.7%、92.7%，表明FNAC是术前诊断甲状腺结节性质的可靠方法。FNAC穿刺后行CS，由于穿刺针上细胞没有完全涂在玻片上，部分细胞随穿刺针丢弃；人为因素致涂片过厚、涂片不均匀，或涂片过程中细胞过度风干[9]；穿刺结节血供丰富，使穿刺针中红细胞或胶质过多，严重稀释滤泡细胞，以上等因素均可使涂片不满意，导致诊断效能下降。因此，解决CS不满意的方法之一是细胞病理学医师床边快速制片、阅片或检测涂片的质量，但这需耗费病理科大量人力，实施难度大。而LBC检测将穿刺标本冲洗至细胞保存液中，多次振荡离心后，去除标本中血细胞、胶质、细胞碎片等干扰成分，液基自动制片仪器制片，将浓缩细胞及诊断成分黏附于载玻片上约直径13 mm范围内，可以提高诊断效能[10-11]。LBC最早应用于妇科宫颈疾病诊断，并得到了充分肯定；近年LBC也广泛应用于非妇科疾病领域，如胸腹腔积液、心包积液、痰标本、支气管镜刷洗[11-12]，在甲状腺结节诊断中也取得了良好的效果。

根据文献报道，LBC与CS两种方法诊断甲状腺结节良恶性的诊断效能分别为94.44%～97.50%和85.56%～90.45%[13]。本研究结果显示，CS检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为72.50%、96.00%、85.56%；LBC检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为85.00%、98.00%、92.22%；LBC对甲状腺乳头状癌的诊断效能均较高，有较好的临床应用价值。但LBC制片过程中存在振荡、离心会引起细胞簇的分散，出现大量单个细胞，且对细胞质有一定影响，导致核质比例增大，出现大量裸核，影响了诊断准确度[1]。

BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中极为常见[14]。BRAF基因可将细胞外刺激信号转导至细胞内，引起一系列细胞反应，从而调控细胞增殖、分化、凋亡、转移等功能[14-16]。据文献报道，BRAFV600E突变在甲状腺乳头状癌、甲状腺未分化癌中检出率分别为29%～83%、10%～24%[17]，本研究结果显示，BRAFV600E基因检测甲状腺乳头状癌灵敏度和准确度分别为67.50%和85.56%，与黄美玲等[18]研究结果相似。BRAFV600E基因检测甲状腺乳头状癌的特异度为100%，因为在正常甲状腺组织、良性结节、滤泡性腺癌及髓样癌中均未能检测到BRAFV600E突变[19]。LBC联合BRAFV600E基因检测甲状腺乳头状癌的灵敏度、特异度、准确度分别为95.00%、98.00%、96.67%，提高了BRAFV600E基因单独检测甲状腺乳头状癌的灵敏度和准确度，值得推广使用。甲状腺乳头状癌中BRAFV600E基因突变可以作为甲状腺乳头状癌的高危因素及独立的预后因子[20]。Lee等[21]通过Meta分析显示BRAFV600E基因突变的甲状腺乳头状癌组织侵袭力高，易向甲状腺外浸润、区域淋巴结转移，临床病理分期更高。

综上所述，LBC技术对诊断甲状腺乳头状癌具有良好的准确度和特异度，BRAFV600E基因检测诊断具有高特异度，两者联合使用，能进一步提高术前对甲状腺乳头状癌诊断准确度，指导临床治疗，并且两者检测操作可行性强、创伤小，临床上值得推广应用。