血清循环microRNA在房颤患者中的表达

周珏珉 白雪

(西南医科大学附属中医院心脑病科，四川 泸州 646000)

房颤(AF)是致死和致残的重要原因，故明确其发病机制显得尤为重要。血浆或血清微小RNA(miRNA)是指血液循环中的胞外miRNA，能稳定存在且容易检测，可作为潜在的生物学标志物。目前研究表明miRNA参与AF的发生发展，提示miRNA可作为AF生物学标志物及治疗方面的潜在靶点〔1,2〕。其中miR-1及miR-21为目前在AF研究较多的小分子RNA，在AF的发病机制中发挥重要作用。然而，二者在AF、阵发性AF或持续性AF中的表达及联合检测价值的研究罕见报道。因此，本研究拟探讨miR-1及miR-21在AF患者中的表达，分析二者与临床指标间的相关性及其在AF中的联合检测价值。

1 资料和方法

1.1研究对象 收集2016年12月至2017年6月于西南医科大学附属中医院心脑病科住院并确诊为AF的患者60例，其中阵发性AF 30例，持续性AF 30例。健康对照组30例来自体检中心，且心电图未发现AF。排除标准：①年龄小于18岁或大于80岁；②器质性心脏病、充血性心力衰竭、冠心病、中至重度血管性疾病；③严重脑血管疾病；④慢性阻塞性肺疾病；⑤肝病、肾病病史；⑥甲状腺功能异常；⑦使用抗心律失常药物。研究对象均知情本项实验研究，并自愿签署知情同意书。患者入院后采集以下信息：年龄、性别、既往病史、药物治疗等情况，常规进行实验室等指标的检测，主要包括总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(Cr)、促甲状腺激素(TSH)、游离甲状腺激素(FT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、前端B型脑钠肽(proBNP)、肌钙蛋白(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)等指标。患者均于西南医科大学附属中医院超声科行心脏彩超检查，检查均由专业超声科医师完成，记录左房内径(LAD)、左室收缩末期内径(LVDs)、左室舒张末期内径(LVDd)及左心室后壁(LVPW)等。

1.2血清miRNA提取，逆转录及实时荧光定量PCR 患者入院后抽取空腹静脉血，离心后取血清于干燥管中，储存于-80℃冰箱中保存。血清总miRNA提取使用天根生化科技(北京)有限公司的 miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒，依照说明书步骤进行实验。釆用日本Takara公司的PrimeScript逆转录试剂盒进行逆转录反应。使用日本Takara公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒配好体系，在美国ABI公司的实时荧光定量PCR仪自带软件上检测Ct值。Ct值超过40定义为未检测到。miR-16用于参照基因，待测样品的miRNA的相对表达量= 2-〔Ct(miRNA)-Ct(miR-16)〕。本研究中所用引物均来自参考文献〔3〕。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计分析。两组间样本均数比较采用t检验或非参数检验，计数资料采用χ2检验或 Fishers 确切概率法。关联性采用两变量关联性分析。本研究中因miRNA相对表达量不符合正态分布，经对数(log2)变换转变为近似正态分布资料。使用受试者工作特征(ROC)曲线评估miRNA作为血清学指标区分疾病的能力。

2 结 果

2.1一般资料分析 与对照组比较，AF组既往病史(高血压、糖尿病)、药物治疗、proBNP、CK-MB、LAD、LVDs、LVDd显著升高(P<0.05)。与阵发性AF比较，持续性AF高血压患者比例较大，proBNP水平亦显著升高(P<0.001)。见表1。

表1 对照组与AF组的一般资料分析

P1值：对照组与阵发性AF组比较；P2值：对照组与持续性AF组比较；P3值：阵发性AF组与持续性AF组比较。体重指数(BMI)、左心室射血分数(LVEF)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)

2.2miR-1、miR-21在对照组、阵发性AF组及持续性AF组中的表达 对照组、阵发性AF及持续性AF组血清Log2miR-1的相对表达水平呈递减趋势，差异有统计学意义(-6.631、-7.770、-8.601，P<0.001)。与对照组(-7.115)相比，阵发性AF及持续性AF组血清Log2miR-21的相对表达水平显著降低(-8.676、-8.761，P<0.001)；持续性AF组与阵发性AF组比较无显著差异(P=0.801)。

2.3miR-1、miR-21的表达与临床指标间的相关性 Log2miR-1与Log2miR-21呈显著正相关(P<0.001)，与LAD、LVDs呈显著负相关(P<0.05,P<0.01)。Log2miR-21与LAD呈负相关(P<0.05)。Log2miR-1及Log2miR-21与proBNP、LVDd等指标有负相关倾向，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4miR-1、miR-21及二者联合检测AF的ROC曲线 联合检测因子使用二元Logistic回归分析获得，公式为miR-1+miR-21×0.443/0.803。结果显示miR-1、miR-21及联合检测因子miR-1×miR-21在区分AF患者方面均有良好的敏感性和特异性〔miR-1：ROC曲线下面积(AUC)=0.812,P<0.001,95%CI=0.710～0.913;miR-21：AUC=0.777，P<0.001,95%CI=0.669～0.885；miR-1×miR-21：AUC=0.826，P<0.001,95%CI=0.732～0.920〕。见图1。

表2 miR-1、miR-21的表达与临床指标间的相关性

图1 miR-1、miR-21及联合检测因子miR-1×miR-21检测AF的ROC曲线

2.5miR-1、miR-21及二者联合检测持续性AF的ROC曲线 联合检测因子使用二元Logistic回归分析获得，公式为miR-1-miR-21×0.886/1.766。结果显示miR-1及联合检测因子miR-1×miR-21在区分阵发性AF及持续性AF患者方面均有良好的敏感性和特异性(miR-1：AUC=0.748，P=0.001,95%CI=0.621～0.874； miR-1×miR-21：AUC=0.782，P<0.001,95%CI=0.668～0.896)。而miR-21 AUC无统计学意义(AUC=0.529，P=0.695,95%CI=0.375～0.684)。见图2。

图2 miR-1、miR-21、联合检测因子miR-1×miR-21检测持续性AF的ROC曲线

3 讨 论

目前越来越多的研究证实miRNA参与AF的发生和发展，例如miR-1、miR-21、miR-26a、miR-29b、miR-30c、miR-133、miR-328以及 miR-499在心肌细胞中大量表达，参与调节心脏生理、兴奋性及心律失常等方面〔4～11〕。血清/血浆循环miR-150、miR-409-3p、miR-432及miR-21可作为AF的潜在生物学指标〔12,13〕。本研究结果提示miR-1及miR-21可能为AF或持续性AF的潜在血清学指标。

miR-21在主要的心血管细胞类型都有表达〔14,15〕，广泛参与心肌细胞肥大、凋亡坏死、成纤维细胞增殖及内皮细胞转化，而这些恰恰是心脏结构重构的主要部分，也是AF诱发和维持的机制。目前研究认为miR-21在心脏结构重构不同的疾病模型及进展表达不一致，且发挥不同的作用。比较多的观点是认为miR-21在成纤维细胞参与的心脏结构重构，如AF患者的心房组织中是上调的〔5,16〕。然而，血清/血浆循环miR-21 的表达却与组织中的表达不同。国外研究发现，与对照组相比，血浆miR-21表达显著下调，与心房组织中的miR-21表达水平成负相关，并且与阵发性AF比较，持续性AF患者的血浆miR-21表达水平亦显著降低〔8,12,17〕。尚有研究发现，与对照组比较，血浆miR-21表达在持续性AF中显著上调，而在阵发性AF中无明显差异〔18〕。以上结果似有差异，推断这种差异可能与纳入患者的背景，如入选和排除标准、并发症、治疗等情况不同有关，而这需要未来更多的研究加以证实。此外，本研究还发现血清miR-21表达与LAD负相关，也从侧面证实miR-21参与了心脏的重构。心肌细胞的miR-1在不同的心脏疾病中表达显著下调，与心脏电传导及心律失常的发生密切相关〔19,20〕。既往研究显示，miR-1的过表达可以抑制超极化激活环核苷酸门控阳离子通道亚单位2/4(HCN2/HCN4)的表达，并且上调K+通道——KCNJ2及 GJA1(编码连接蛋白43，心肌缝隙连接通道的主要蛋白)的表达，进而降低心房传导速度以及复极化，阻止心律失常的发生〔21,22〕。还有研究发现，在肥大的心肌细胞miR-1表达下降，并且用miR-1转染心肌细胞后，CANCNB2表达下降，提示miR-1通过抑制L型Ca2+通道——CANCNB2表达阻止心房重构〔23〕。本研究提示左心的结构和功能指标与miR-1表达水平的一种负性变化。这也从侧面反映了miR-1与心房重构的关系，miR-1水平越低，可能提示心脏功能及心房结构情况改变更加严重。

本研究结果推断循环miR-1及miR-21可用于联合检测AF。相关文献显示，在高血压的大鼠模型中，主动脉组织的miR-1表达水平下调〔24〕。而proBNP是反映心功能障碍最为准确的血清学指标。因此，鉴于阵发性AF和持续性AF在分类和定义方面的相似性，未来需要更准确的实验证实miR-1在区分两种疾病中的作用。