肺癌早诊呼吸分析研究现状与临床应用前景

陈情 孙美秀 李静 崔文静

1天津医科大学肿瘤医院心肺功能科 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市 “肿瘤防治”重点实验室 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心300060；2中国医学科学院&北京协和医学院生物医学工程研究所，天津300192

据WHO的数据显示，全球每年约有160万人死于肺癌。肺癌已成为全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤。我国是世界上肺癌患者最多的国家，每年约73万人被确诊为肺癌[1]。

临床研究资料表明，原位癌治愈率接近100%，Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%～90%，而Ⅲ期和Ⅳ期患者的5年生存率仅5%～20%，目前肺癌5年生存率仅为18%，部分原因是约75%的患者在确诊时已属肺癌中晚期[2-3]。若肺癌在早期阶段被检测出来，通过手术治疗，5年生存率可达到50%～70%[4]。因此早期检测对于肺癌患者至关重要。

目前，用于肺癌的早期诊断方法包括痰细胞学[5]、循环生物标记物[6]、CT/低剂量计算机断层扫描[7]、MRI[8]、和胸部X射线[9]。除成本外，这些测试的辐射或者入侵性都会给患者造成一定的担忧。最重要的是，这些测试结果尚未得到最终对病情的证明。因此开发一种无创、成本低廉的检测方法一直是人们所追求的。

肺癌细胞具有高代谢的特点，自身可持续异常合成分泌各种特殊成分物质，最有可能释放某些癌症标记特征直接进入呼吸系统。在较早的呼出气体中可以检测到呼出的挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)，其在体内代谢过程提供患者潜在的疾病信息[10]，因此，呼出的VOCs可作为肺癌诊断的生物标记物。

1 呼吸分析技术用于肺癌早期诊断的机理研究

机体在一些病理状态下，呼气中VOCs的成分会发生改变，呼气分析通过检测呼气中VOCs成分的变化反映机体的病理生理状态，但到目前为止，肺癌和呼出气中的VOCs的关系尚未明确。Smith等[11]通过选择性子流量管光谱测定法发现肺癌细胞株的培养液顶层空气中测得的挥发性有机气体乙醛在肺癌细胞株培养16 h以后开始增高，并与肺癌细胞的数量的升高成比例，说明肺癌细胞本身产生了特征性VOCs。而Poli等[12]，发现肺癌患者在进行肿瘤切除术后相关VOCs水平下降，也进一步证实了肺癌细胞本身可以产生VOCs。其他体系中的研究表明VOCs的代谢产生与细胞氧化应激相关，其中氧自由基与癌的产生密切相关。氧自由基可以导致肺损伤。当中性粒细胞进入肺并释放氧自由基时，可引起蛋白质、多种不饱和脂肪酸及DNA等的过氧化损伤[13]。通过脂质过氧化反应，细胞膜上的多种不饱和脂肪酸分解代谢为已烷、戊烷、甲烷等烷烃类物质，这些物质在血液中溶解度极低，一部分易挥发的烷烃很快就经过气血交换，直接经呼吸系统排出体外；细胞膜的损伤也增加了肺泡细胞对VOCs通透性。此外，在肺癌的研究中发现细胞色素P450酶与肺癌存在一定的相关性[14]，这些烷烃类物质也可通过细胞色素P450混合酶系统代谢，将其氧化成烷醇，排出体外。

因此，肺癌中特征性VOCs的代谢产生机制并非单一因素主导，而是由多因素共同参与。

2 用于肺癌早期诊断的呼吸分析技术及采样方法

不同的研究小组使用各种各样的取样和检测方法来鉴定生物标记物。呼气分析中关于气体的收集主要是在操作中避免气体外漏和外界气体的污染，最常用、最受欢迎的取样技术是泰德拉袋，这也是美国环境保护署推荐用于VOCs检测的取样方法[15]。

大多数分析呼出气体的研究使用的是气相色谱质谱仪(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)和/或电子鼻。GC-MS已经在研究组中广泛使用[16]。GC-MS是一种强大的工具，可以定性和定量地鉴定混合物中存在的每种挥发性化合物，但是需要充分准备的样品，训练有素的人员，并且价格昂贵[17]。固相微萃取技术通常与GCMS结合用于样品的预浓缩和制备。电子鼻分析技术是由一系列电子化学传感器和适当的模式识别系统组成的仪器。例如石英微天平气体传感器或分子改进的金纳米颗粒，是基于传感器材料的化学反应。它们可以提供高敏感度的测试结果[18-19]，相对便宜，体积较小，易于使用和携带，但是检测选择性较低，需要经常校准，不能检测定量结果或识别呼吸中的每一种成分。

质子转移反应质谱法是一种使用气相水合氢离子作为离子源试剂的分析化学方法[20]。一种不需要预浓缩的技术，其检测下限优于GC-MS，提高了敏感度，且操作简单快速，但也因自身某些因素的限制，在应用推广方面不及GC-MS广泛。

除了以上的呼吸气体检测技术，近年来光谱技术在呼吸领域也不断发展。与质谱技术相比，激光光谱技术不但具有高敏感度、高选择性的优点，而且具有低成本、实时性及即时检测的功能特点。测量到的生物标记物的光谱图谱范围从紫外到中红外，而激光技术所达到的检测极限范围从百万分之一到十亿分之一。目前，在已确定的30多种呼吸生物标记物中，研究人员采用可调谐半导体激光吸收光谱技术[21]、光腔衰荡光谱技术[22]以及光声光谱技术[23]进行了人体多种呼吸生物标记物实验。

3 呼吸分析技术用于肺癌早期诊断的标记物研究

用于呼吸分析的标准程序不一致性是获得不同结果的主要原因，绝大多数的研究进行了病例对照的方法。与临床诊断的患者相比，健康对照组中没有发现肺癌的征兆，因此它们被认为是无癌的。表1根据呼吸气体分析，按照发表年代的顺序，描述了肺癌患者和健康志愿者对照分类的敏感度、特异度和准确率以及生物标记物的统计信息，肺癌的敏感度及特异度为51%～100%、13%～100%不等。但是，所有研究都没有进行严格的验证，这可能会导致检测结果过于乐观。

不同的文章进行了不同的多变量统计方法，例如模糊逻辑、主成分分析或神经元网络等来确定物质的浓度。为了确认哪些物质为生物标记物，在统计数据处理的过程中，物质的浓度需要在癌症患者和健康者对照组之间的差异显示出来。这些浓度的极限值可以在研究的文章中找到。

4 呼吸分析技术用于肺癌早期诊断面临的挑战与机遇

肺癌是全世界恶性肿瘤致死的首要原因，其发病率和病死率呈不断上升的趋势。呼吸分析技术在肺癌诊断中的地位已经没有争议，但是如何能便捷地用于临床操作，有效地进行分析以用于筛查诊断，是我们面临的一项重大挑战。到目前为止，所有的研究均表明肺癌患者的呼出气体标记物尚未统一，各种研究的主要弱点是缺乏用于呼吸分析的标准化方法，这是评估所获得的结果的相关性和可靠性的依据。例如，在上述所有的研究中，每篇文章所检测的标记物种类不同，数量不同。此外，如前所述，独立于各种分析技术，呼吸样品采集和存储的不统一都构成了其他一些主要的差异。创建标准化呼吸样品采集和存储方法是产生可靠结果的挑战。此外我们还需要大量的临床实验研究，以确定呼吸气体试验在肿瘤患者中干预和改善生存率方面是否具有远期的效果，从而真正评判其价值。

表1 呼吸分析检测肺癌的性能以及生物标记物

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突