IL-27在结核性胸腔积液中的表达水平及临床意义

程亮 陈华昕 赵新国 陈惠芬 华少鹏 施敏骅

1无锡市第五人民医院呼吸科214005；2苏州大学附属第二医院呼吸科215004

结核性胸膜炎是一种由结核分枝杆菌引起的胸膜炎症病变，传统的诊断方法是依靠显微镜下胸腔积液涂片中找到抗酸杆菌，但其阳性率很低，仅7%～13%不等[1]。胸腔积液结核菌培养可显著提高检测阳性率至23%～67%[2]，但其培养周期长达1个月。通过内科胸腔镜对胸膜病变进行病理活检可以作为诊断结核性胸膜炎的金标准，然而内科胸腔镜是侵入性的，增加了相关并发症的发生，并且胸腔镜技术在多数基层医院仍未广泛普及，因此有必要寻找一种快速、有效、简便的方法来辅助诊断结核性胸膜炎。本研究探讨结核性胸膜炎患者胸腔积液及外周血中IL-27的表达及其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象及诊断标准

1.1.1 研究对象及分组 根据结核性胸膜炎和恶性胸腔积液的最新诊断标准[3-4]，对2017年11月至2018年5月无锡市第五人民医院呼吸科收治的胸腔积液患者进行筛选，最终67例结核性胸膜炎患者中共有53例纳入本项研究(7例随访流失，5例临床诊断患者修正为其他疾病，2例患者追问病史接受过抗结核治疗)，为结核组，其中男31例，女22例；年龄(38.3±7.8)岁，年龄范围为19～65岁。结核组中确诊病例30例，包括胸腔镜病理活检明确结核12例，胸腔积液结核菌培养阳性8例，胸腔积液结核菌核酸检测阳性12例；临床诊断23例。共49例恶性胸腔积液患者纳入本项研究，为恶性组，其中男29例，女20例；年龄(62.5±10.3)岁，年龄范围为46～78岁。以50名体检中心健康体检人员为健康对照组，其中男23名，女27名；年龄(59.3±5.3)岁，年龄范围为52～68岁。所有患者未接受过抗肿瘤治疗、免疫治疗或抗结核治疗，未使用过糖皮质激素或免疫抑制剂或非甾体抗炎药。本研究通过无锡市第五人民医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.1.2 诊断标准 结核组入选标准依据2017年《中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断》[3]。结核性胸膜炎确诊标准:(1)胸膜病理检查支持结核；(2)胸腔积液抗酸杆菌阳性2次；(3)胸腔积液抗酸杆菌阳性1次，结核分枝杆菌培养阳性1次；(4)胸腔积液结核分枝杆菌核酸检测阳性。结核性胸膜炎临床诊断标准:(1)胸腔积液为渗出液，腺苷脱氨酶升高，同时γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)释放试验阳性；(2)胸腔积液为渗出液，腺苷脱氨酶升高，同时PPD中度阳性或强阳性；(3)胸腔积液为渗出液，腺苷脱氨酶升高，同时结核分枝杆菌抗体阳性。

恶性组入选标准:在胸腔积液细胞沉淀中找到恶性细胞，或在胸膜活检组织中观察到恶性肿瘤的病理变化[4]。

健康对照组入选标准:无锡市第五人民医院体检中心参加健康体检的人员(年龄≥18岁)，常规体检结果均正常。

1.2 实验方法

1.2.1 主要的试剂和仪器 IL-27酶联免疫吸附试验试剂盒(美国Bio Legend公司)；酶标仪(美国Biokit公司)；低温高速离心机、HERAcell 150i二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)；ELx-800型全自动酶标分析仪(美国biokit公司)；FC500型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)；Th1/Th2细胞因子检测试剂盒(美国BD公司)。

1.2.2 标本收集 入院24 h内采集结核组及恶性组患者空腹外周静脉血20 ml，留取健康对照者的体检残余血5 ml，存于肝素抗凝管中。采用标准的胸腔穿刺术采集结核组及恶性组患者胸腔积液并用肝素抗凝。所有标本均经离心半径为16 cm，2 000 r/min离心5 min，取上清液置于-80℃冰箱冻存。

1.2.3 酶联免疫吸附试验检测 将50 ml的20×洗涤液溶于950 ml的蒸馏水里作为缓冲液。将2.06 ml的缓冲液加入到冻干的人类IL-27标准品瓶里，放于振荡器上混匀。用缓冲液将标准品储备液倍比稀释为16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、1μg/L、500 ng/L、250 ng/L。用1×洗涤液洗板，每次洗板将1×洗涤液浸泡96孔板30 s。每孔加入50μl的缓冲液。每孔加入50μl的标准品溶液或标本。用封板模封板，在摇床上摇10 min后放于室温孵育110 min。然后倒掉孔内溶液后洗板4次。每孔加入100μl的IL-27检测抗体然后用封板模封板，摇床上摇10 min后放于室温孵育50 min。然后倒掉孔内溶液后洗涤液洗板4次。每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的检测液体，避光放于37℃温箱内孵育，40 min后除空白对照孔外其余孔都变蓝。每孔加入100μl的终止液终止反应，轻敲混匀。在30 min内，在酶标仪450 nm下读吸光度值。用Curve Expert 1.3 Setup绘制标准曲线，得出相应的浓度(ng/L)。

1.2.4 流式细胞术检测 将冻干的人Th1/Th2标准品转移到15 ml锥形离心管中，并标记该管为最高浓度标准品。取出9根12 mm×75 mm流式上样管，分别标记梯度稀释的倍数1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。从1∶2管取300μl液体到1∶4管，吹打混匀，依此类推，直到1∶256管。确定实验管数(包括标准品和对照管)，混合前每种捕获微球需充分涡旋3～5 s。为保证每个实验管都含有7种微球，每种捕获微球需各取10μl。将混合好的捕获微球200×g离心5 min，小心吸去上清，室温避光孵育30 min。涡旋混匀混合好的捕获微球，每个实验管都加入50μl待测样本。所有实验管中都加入50μl人Th1/Th2 PE检测试剂。所有实验管室温避光孵育3 h。每管加入1 ml洗液，200×g离心5 min，弃去上清，每管加300μl洗液，重悬微球。完成样本数据获取后，使用FCAP Array软件来进行人Th1/Th2细胞因子数据分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0以及Graph pad prism 6.0软件进行数据分析并绘制统计图。所有数据使用Komogorov-Smirnov test检验变量是否服从正态性分布，符合正态分布的计量资料采用表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；两组间的率比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。绘制受试者工作特征曲线，根据曲线下面积(area under curve，AUC)综合评价诊断试验的诊断价值。

2 结果

2.1 治疗前不同性质胸腔积液及血清中IL-27的水平 结核组胸腔积液IL-27水平、IL-27胸腔积液/血清均高于恶性组(t=8.47、8.32，P值均＜0.05)。恶性组血清IL-27水平高于结核组及健康对照组，差异无统计学意义(F=2.76，P＞0.05)。结核组胸腔积液IL-27水平显著高于其血清IL-27水平(t=11.30，P＜0.001)。见表1。

表1 3组受试者血清及胸腔积液中IL-27浓度的比较()

表1 3组受试者血清及胸腔积液中IL-27浓度的比较()

注:与健康对照组比较，a P＜0.05；与胸腔积液比较，b P＜0.05

组别 例数 血清(ng/L)胸腔积液(ng/L)胸腔积液/血清结核组 53 285.20±44.59ab 516.45±144.25 1.85±0.56恶性组 49 293.16±59.37 313.30±86.61 1.09±0.32健康对照组50 264.28±84.37统计值 F=2.76 t=8.47 t=8.32 P值 0.066 ＜0.001 0.005

2.2 不同性质胸腔积液中IL-2、IL-10、IFN-γ的基线水平 结核组胸腔积液IL-10及IFN-γ水平高于恶性组(t=3.04、9.81，P值均＜0.05)，结核组与恶性组胸腔积液IL-2水平比较，差异无统计学意义(表2)。

表2 结核组与恶性组患者胸腔积液中IL-2、IL-10、IFN-γ的比较()

表2 结核组与恶性组患者胸腔积液中IL-2、IL-10、IFN-γ的比较()

注:IFN-γ为γ-干扰素

组别 例数IL-2(ng/L)IL-10(ng/L)IFN-γ(ng/L)结核组53 28.00±8.95 398.08±19.45 704.17±169.53恶性组49 25.81±6.16 366.53±73.76 465.80±45.65 t值 1.58 3.04 9.81 P值 0.120 0.004 ＜0.001

2.3 胸腔积液IL-27、IL-10、IFN-γ以及联合三者对结核性胸膜炎的诊断价值 胸腔积液IL-27的cut-off值 为377.3 ng/L时，约 登 指 数 最 高(0.66)，AUC为0.915，95%CI:0.862～0.969，诊断结核性胸膜炎的敏感度为88.0%，特异度为78.0%。胸腔积液IL-10的cut-off值为371.67 ng/L时，约登指数最高(0.57)，AUC为0.629，95%CI:0.506～0.751，诊断结核性胸膜炎的敏感度为87.1%，特异度为58.5%。胸腔积液IFN-γ的cut-off值为513.65 ng/L时，约登指数最高(0.71)，AUC为0.897，95%CI:0.836～0.959，诊断结核性胸膜炎的敏感度为81.1%，特异度为90.6%。诊断结核性胸膜炎的多变量受试者工作特征曲线分析显示，胸腔积液中IL-27、IL-10及IFN-γ联合的cut-off值为0.43时，约登指数最高(0.87)，AUC为0.983，95%CI:0.964～1.000，诊断结核性胸膜炎的敏感度为95.9%，特异度为90.6%(图1)。

图1 多种细胞因子诊断结核性胸腔积液的受试者工作特征曲线

3 讨论

既往的研究已表明[5]，宿主感染了结核分枝杆菌后，主要产生Th1型免疫应答，分泌大量炎性因子，促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子和趋化因子之间的相互作用和比例失衡与结核性胸膜炎的发病有关。在结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-10和IFN-γ可显著增高，对结核性胸膜炎患者的辅助诊断具有较高的敏感度和特异度，而细胞因子检测在结核感染诊断中的价值已被越来越多的临床研究证实[6]。自IFN-γ检测被引入临床酶学后，已逐渐应用于临床辅助诊断结核性胸膜炎[7]，甚至在欧美国家IFN-γ释放试验已被批准取代PPD法用于临床检测结核菌感染[8]。但也有一部分研究者认为实际情况并非如此，并对相关的文献回顾分析发现[9]，胸腔积液IFN-γ检测结核性胸膜炎的敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值、阴性预测值、诊断优势比分别为78%、82%、3.49、0.24、85%、70%和19.04，并且认为胸腔积液IFN-γ无法区分活动性和非活动性结核，结果易受接触活动性结核患者和结核感染等因素影响，因此其作为单独指标在临床诊断中意义有限，而相对来说用于排除结核感染的意义更大。同时也有研究发现IL-10可作为辅助诊断结核病的生物标记物之一。Joshi等[10]通过测定活动性肺结核患者、家庭接触者和健康对照组血清中IL-10的浓度，发现IL-10可用于区分以上三者。

本研究结果显示，结核组患者胸腔积液IL-27水平较恶性组增高，并且结核组患者IL-27胸腔积液/血清较恶性组亦明显增高，推测胸腔中的IL-27不是来自外周血，而是由胸腔积液局部微环境中产生的，原因可能是结核分枝杆菌侵犯入胸膜腔导致胸膜血管通透性增加，形成以淋巴细胞为主的渗出液，诱发局部以CD4+T淋巴细胞为主的迟发型超敏反应所致[11]。活化的CD4+T淋巴细胞分泌大量IFN-γ，IFN-γ可以 诱 导Th0细 胞向Th1细胞分化，活化更多的细胞毒性T淋巴细胞和效应T细胞以杀死或抑制结核分枝杆菌。IL-27由活化的单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞产生，继而可以诱导IFN-γ的产生[12]，因此我们推测结核性胸腔积液微环境中IFN-γ水平与IL-27水平呈正相关性。有文献表明IL-27作为鉴别诊断结核性胸腔积液的参考指标得到了普遍肯定[13]，但其检测结果在国内外众多试验中存在差异，分析原因可能为:(1)胸腔积液中结核分枝杆菌抗原刺激单核细胞产生IL-27呈时间-剂量依赖关系，因此结核感染的不同时期胸腔积液中产生的IL-27存在差异[14]。(2)部分试验样本量仍偏少，导致试验结果差异较大。同时在本研究中也发现，恶性胸腔积液患者胸腔积液IL-27浓度高于其血清，这可能与IL-27可直接抑制部分肿瘤细胞的增殖，且其在肿瘤微环境中还具有抗血管生成作用有关[15]，但其免疫学机制尚不完全清楚，仍需进一步研究。

为进一步探索IL-27在结核性胸膜炎中的诊断价值，本研究采用受试者工作特征曲线来检验此指标的诊断效能，发现IL-27水平具有对结核性胸膜炎和恶性胸膜炎的鉴别诊断价值。本研究通过对多个细胞因子进行同步检测发现，结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-10和IFN-γ显著高于对照组，进一步分析显示在结核性胸腔积液中IFN-γ的特异度最高，但敏感度差，IL-27的敏感度在三者中最高，但其特异度略低于IFN-γ，而IL-10的特异度和敏感度在三者比较中均无优势。因此，在进行排除诊断时可以选择特异度较高的IFN-γ，而确诊时则选择敏感度较高的IL-27，并且IL-10、IL-27和IFN-γ3种细胞因子联合诊断的敏感度与特异度分别为95.9%和90.6%，和单独使用IL-27检测相比无明显优势，而同时检测多个细胞因子费用则明显增高。

鉴于胸腔积液IL-27检测对于诊断结核性胸膜炎拥有较高的敏感度和特异度，特别是酶联免疫吸附试验检测法相对流式检测费用更低，操作程序简单，技术要求低，可作为适宜技术向基层医院进行推广和普及。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突