HPLC同时测定金羚感冒片中绿原酸、马钱苷和蒙花苷的含量

薛剑桥，毕春艳，周 三

（1.青岛大学 药学院 天然药物与生药学系，山东 青岛 266021；2.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博255086）

金羚感冒片是由水牛角浓缩粉、羚羊角、忍冬藤、野菊花、北豆根、阿司匹林、扑尔敏、维生素C八味药组成，有辛凉解表，清热解毒的作用，用于伤风感冒及上呼吸道感染[1]。其质量标准颁布时间较早，标准简单，只有方中用量最小的扑尔敏的鉴别，其他成分没有质控项目，无法较好地考察该品种的质量。

方中投料量最大的为忍冬藤，忍冬藤具有清热解毒，疏风通络的功效。忍冬藤药典规定的指标成分为绿原酸和马钱苷。忍冬藤可通过绿原酸作用在2条信号通路部分环节发挥抗炎作用[2]。绿原酸类化合物对多种病毒有较强的抑制和杀灭作用[3-4]。方中臣药为野菊花，能治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、头痛眩晕等症。现代研究表明，野菊花含黄酮类、挥发油和萜类、多糖、有机酸类及微量元素等多种化学成分，它们是野菊花药理作用的物质基础，而总黄酮和挥发油是野菊花的主要成分，近年的研究也逐渐受到关注[5]，野菊花中的黄酮类成分具有抗炎免疫、肝保护、抗肿瘤、保护心血管系统、抗菌等多种药理作用[6-10]。野菊花药典规定的指标成分为黄酮类之一──蒙花苷。为了提高其质量标准，确保临床应用的安全有效，本文采用高效液相色谱法（HPLC）法同时测定绿原酸、马钱苷和蒙花苷3种成分的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），配备SPD-20A UV/VIS检测器及LC-solution工作站；Mettler Toledo MS205DU电子天平（梅特勒-托利多公司）；BWS-10恒温水浴锅（上海一恒公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号110753-201314）；马钱苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111640-201005）；蒙花苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111528-201710）；金羚感冒片3批（山东润华药业，批号：03161203，03170301，150903）； 甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.6 %冰醋酸溶液，梯度洗脱：0～30 min，甲醇20 %～52 %， 30～60 min，甲醇48 %，柱温为30 ℃；流速为1.0 ml/min。理论板数按绿原酸峰计应不低于3000。相邻两峰的分离度应不小于1.5。拖尾因子应在0.95～1.05之间。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、马钱苷、蒙花苷对照品各10 mg，分别置入50 ml量瓶，作为对照品储备液。临用时，精密吸取上述3种对照品储备溶液各1 ml，置入同一5 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，密塞，称定重量，加热回流60 min，放冷，称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例及制备工艺制备不含忍冬藤、野菊花外的其他药味，按2.2.2项下方法操作，制得阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取2.2项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定。结果表明，供试品溶液中，分别在与绿原酸、马钱苷和蒙花苷对照品相应位置上有相同保留时间的色谱峰，阴性对照品对测定无干扰，见图1。

图1 对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液HPLC图谱

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下对照品溶液2，4，8，10，20 μl，注入高效液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定，测定峰面积。以进样量（μg）对峰面积（A） 进行线性回归，得绿原酸回归方程为Y=32330X-1761，r=0.9999；马钱苷回归方程为Y=84 922X+7344，r=0.9999；蒙花苷苷回归方程为Y=13 274X+3835，r=0.9993，结果表明，绿原酸在0.0750～0.7496 μg、马钱苷在0.0889～0.8888 μg、蒙花苷在0.0866～0.8664 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液10 μl，按规定连续进样6次，记录峰面积。结果绿原酸、马钱苷、蒙花苷峰面积的RSD分别为0.11 %，0.23 %，0.25 %（n=6）。表明仪器的精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批金羚感冒片（批号为03161203）样品6份，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定。结果绿原酸、马钱苷、蒙花苷平均含量分别为0.9329，2.3990，1.0644 mg/g，RSD分别为1.0 %，1.1 %，0.9 %（n=6）。表明用本方法测定绿原酸、马钱苷、蒙花苷的含量重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批金羚感冒片（批号为03161203），按2.2.2项方法制备供试品溶液，分别于放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1项色谱条件测定。结果绿原酸、马钱苷、蒙花苷峰面积的RSD分别为0.1 %，0.2 %，0.2 %。表明供试品溶液在24 h内稳定，能满足测定的需求。

2.3.6 加样回收试验 分别取同一批金羚感冒片（批号：03161203，绿原酸、马钱苷、蒙花苷含量分别为0.9329，2.3990 ，1.0644 mg/g）样品约0.25 g，精密称定，共6份，分别精密加入绿原酸对照品储备溶液1 ml、马钱苷对照品储备溶液3 ml、蒙花苷对照品储备溶液1 ml，50 %甲醇20 ml，按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，计算加样回收率。结果绿原酸、马钱苷、蒙花苷的平均回收率分别为102.1 %，103.3 %，102.4 %，RSD分别为0.9 %，1.2 %，1.1 %（n=6）。结果表明，本法的准确度较好。

2.4 样品测定

取3批金羚感冒片（批号分别为03161203，03170301，150903），分别按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，计算绿原酸、马钱苷、蒙花苷的含量，结果见图3。

图3 供试品中绿原酸、马钱苷、蒙花苷含量测定（n=3）

3 讨论

金羚感冒片原标准无含量测定项，不能有效评估其产品质量，临床效果也难以确认。本文测定金羚感冒片中君臣药味中的3种主要成分，为有效控制产品质量提供参考。流动相的选择参考多篇文献，尝试了不同的流动相和不同比例[11-17]，发现分离效果均不理想，后尝试梯度洗脱，最终确定用甲醇和0.6 %冰醋酸进行梯度洗脱得到的峰形较好，分离度能达到要求。检测波长的选择参考了药典中忍冬藤和野菊花的检测波长226 nm[17]和334 nm[17]，试验后发现波长334 nm处检测不到马钱苷峰，波长226 nm处3个对照品峰形都很好，故检测波长选择226 nm。

考察了50 %甲醇，75 %的甲醇，甲醇、50 %乙醇、75 %乙醇、乙醇的提取效果，结果显示50 %甲醇优于其他溶剂，故采用50 %甲醇提取。同时对溶剂用量及提取时间进行了考察，最终确定以50 %甲醇加热回流提取60 min作为制备供试品溶液的条件。