基于液质联用技术采用正交设计优选制川乌单酯型生物碱醇提工艺

周长凯，徐 文，高 静，曹铭晨，纪洪艳，姚景春，张 娜，刘永军，荆凡波*

（1.青岛大学附属医院，山东 青岛 266100；2.青岛市第三人民医院，山东 青岛 266041；3.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 273400；4.山东大学 药学院，山东 济南 250012）

川乌为毛茛科植物乌头的干燥母根，制川乌为川乌的炮制加工品，其味辛、苦，热，有毒。归心、肝、肾、脾经，具祛风除湿、温经止痛之功效，具极高的药用价值。现代研究证实，川乌具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫、镇痛[1-4]等药理作用，但因其毒性，川乌临床应用受极大限制。双酯型生物碱为其川乌的主要毒性成分，经炮制后，可转化为单酯型生物碱，毒性为双酯型生物碱的0.002～0.005[5-7]，在保持药理活性的同时安全性得到极大提升，具有广阔的应用前景。然而，目前尚无制川乌提取物相关制剂，且对其单酯型生物碱的提取相关研究极为匮乏，本试验拟采用正交试验优化制川乌单酯型生物碱醇提工艺，以期为工业化大生产及新制剂研发提供数据支持。

1 仪器、药品与试剂

API4000+三重四极杆串联质谱系统，Agilent 1290II高效液相色谱仪。苯甲酰新乌头原碱，苯甲酰次乌头原碱，苯甲酰乌头原碱对照品由上海一林生物科技有限公司提供。制川乌饮片购自药材市场。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 液相色谱分析条件

色谱柱：Ultimate AQ-C18柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm，上海月旭科技有限公司），柱温40 ℃，流速：0.4 ml/min。流动相：0.1 %甲酸水-甲醇=55:45。

2.2 质谱分析条件

电喷雾电离离子源，源电压5.5 kV，毛细管温度为550 ℃，鞘气流速40，正离子检测，质量分析器为四级杆，采用MRM模式检测，检测条件与MRM图分别见表1、图1。

表1 MRM条件表

图1 苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的MRM图

2.3 供试品溶液的制备

取制川乌中粉10 g置于圆底烧瓶中，加75 %乙醇250 ml，加热回流提取1 h，提取液定容至250 ml，滤过，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品各10 mg，分别置10 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别将苯甲酰新乌头原碱（1 mg/ml）、苯甲酰次乌头原碱（1 mg/ml）、苯甲酰乌头原碱（1 mg/ml）溶液稀释1000，2000，5000，10 000，20 000和50 000倍，依次注入液-质色谱仪，记录峰面积。分别以进样量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，苯甲酰新乌头原碱回归方程为：Y=2.92×103X+1.31×102，r=0.9995；苯甲酰次乌头原碱回归方程为：Y=4.37×103X+1.55×102，r=0.9998；苯甲酰乌头原碱回归方程为：Y=1.12×103X-1.05×102，r=0.9996。结果表明, 苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在20～1000 ng范围线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液10 μl，连续进样6次，记录峰面积。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱峰面积RSD值分别为1.46 %，1.27 %，1.19 %，表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h进样，记录峰面积。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的峰面积RSD值分别为1.14 %，1.35 %，1.27 %（n=6），表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 按2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取10 μl进样测定。计算得到供试品中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱含量RSD值分别为1.26 %，1.32 %，1.13 %，表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收试验 取9份已知含量的供试品，每份约1.00 g，精密称定，分别精密加入3种对照品的量相当于供试品中含各对照品量的80 %，100 %，120 %，每个水平平行3份。按2.3项下方法制备供试品溶液。按2.1、2.2项下条件进行测定，记录色谱峰面积，计算单酯型生物碱含量（以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱之和计）、加样回收率及RSD值，见表2。结果表明，3种浓度的平均加样回收率为100.9 %，101.5 %，101.9 %，RSD值为1.21 %，1.86 %，2.50 %。

表2 加样回收试验结果

2.5.6 定量限与检测限考察 取2.4项下的对照品溶液适量，倍比稀释，按2.1项和2.2项的条件连续测定6次，记录峰面积。以最低定量限和检出限信噪比S/N=10和S/N=3为原则，计算定量限为与检测限分别为0.0200，0.0065 μg/ml。

2.6 单因素试验

2.6.1 提取次数对单酯型生物碱含量的影响 取制川乌中粉10 g，置入圆底烧瓶，加75 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，滤过。残渣；参照第一次的处理方法，分别提取2次。测定3个样品中单酯型生物碱含量，结果见图2。

图2 不同提取次数单酯型生物碱含量

2.6.2 粉碎粒度对单酯型生物碱含量的影响 分别取制川乌饮片、粗粉、中粉、细粉各10 g，置入圆底烧瓶，加75 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，滤过，取续滤液，测定样品中单酯型生物碱含量，结果见图3。

图3 不同粉碎粒度单酯型生物碱含量

2.6.3 乙醇浓度对单酯型生物碱含量的影响 取制川乌中粉10 g，置入圆底烧瓶，分别加35 %，55 %，75 %，95 %乙醇250 ml，回流提取1 h，提取液定容至250 ml，滤过，取续滤液，测定样品中单酯型生物碱含量，结果见图4。

图4 不同乙醇浓度单酯型生物碱含量

2.6.4 乙醇倍量对单酯型生物碱含量的影响 取制川乌中粉10 g，置入圆底烧瓶，分别加75 %乙醇50，150，250，350，450 ml回流提取1 h，提取液定容至500 ml，滤过，取续滤液，测定样品中单酯型生物碱含量，结果见图5。

图5 不同乙醇倍量单酯型生物碱含量

2.6.5 提取时间对单酯型生物碱含量的影响 取制川乌中粉10 g，置入圆底烧瓶，加75 %乙醇250 ml，分别回流提取0.5，1，1.5，2，2.5 h，提取液定容至500 ml，滤过，取续滤液，测定样品中单酯型生物碱含量，结果见图6。

2.7 正交试验

图6 不同提取时间单酯型生物碱含量

2.7.1 正交试验表 根据单因素试验结果，提取2次已把目标成分提取完全，第3次提取量仅为前两次总和的0.86 %，故固定提取次数为2次。粉碎粒度方面，细粉较中粉目标成分含量升高仅0.93 %，综合考虑生产可操作性与成本，选择粒度为中粉。乙醇浓度方面，随着乙醇质量分数的升高成分含量逐渐升高，至75 %时含量最高，此浓度下目标成分溶解性高，95 %时含量出现显著下降，故选择邻近浓度65 %，75 %，85 %为正交试验因素水平。溶剂倍量方面，随提取体积增大成分含量逐渐升高，25倍量（250 ml）时已提取较充分，35，45倍时含量无明显增加，故选择15，25，35倍作为正交试验因素水平。提取时间方面，当提取1.5 h时成分含量最高，提取较完全，2 h时开始下降，长时间加热可能会使单酯型生物碱进一步水解，故选择1，1.5，2 h为正交试验因素水平。

表3 正交因素水平表

2.7.2 正交试验结果

由表4可知，极差RA＞RC＞RB，即影响因素主次顺序为：乙醇浓度＞提取时间＞乙醇倍量。从表5方差分析结果表明，对于目标成分的提取，乙醇浓度影响显著，提取时间和乙醇倍量有一定影响。根据k值进行分析，得到最优工艺为A2B2C3，但C3的单次提取时间为2 h，时间偏长，且提取效果非显著优于C2水平，综合考虑生产实际、环保等因素，确定A2B2C2为最佳工艺，即乙醇浓度75 %，乙醇倍量25倍，每次提取1.5 h。

表4 L9(34)正交试验

表5 方差分析表

2.8 工艺验证性试验

为验证所得组合工艺的可行性，进行了3批验证试验，按优选工艺进行提取，测定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱，结果见表6。可见，验证试验的平均值为12.87，RSD为1.91 % (n= 3)，表明正交试验优选的条件稳定可行，可作为制川乌单酯型生物碱的提取工艺。

表6 验证性试验结果

3 讨论

中药川乌中二萜生物碱为其主要的化学成分，也是川乌的主要药效成分，以 C-19二萜生物碱为主，包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等有毒的双酯型生物碱，其经过炮制可成为低毒的单酯型生物碱如苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱等，从而达到增效减毒的目的，使制川乌的临床使用安全性得到极大提升，但是针对制川乌单酯型生物碱的提取、药理及机制相关研究相对匮乏，以致市面上仍无制川乌提取物的相关制剂，因此未来制川乌新制剂的开发创制具有广阔的市场空间。

在正交试验目标成分的选择上，制川乌中主要含有单酯型生物碱，双酯型生物碱含量相对较低，且2015年版中国药典对乌头碱、次乌头碱、新乌头碱3种双酯型生物碱含量之和设定上限不得过0.04 %，本试验参考药典含量测定项，选取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱3种单酯型生物碱特征成分为指标成分，以含量之和记为单酯型生物碱含量，作为工艺优选的指标。在提取方法上，我们通过预实验发现在未调pH情况下，本研究所用醇提法较之药典提取法，对指标成分的提取率更高，醇提法亦更适于工业化生产。此外，在提取过程中发现目标成分含量较低，且3种成分的含量相差很大，苯甲酰乌头原碱含量极低，在预实验中出现过未检测出的情况，但在工艺优选后，其含量较稳定，优化后提取工艺简单、可靠，对日后制川乌的深入开发以及单酯型生物碱新制剂的工业化生产具有一定的参考意义。