Russel Silver综合征19例病例系列报告

张 萍 刘仁超 陆 炜 吴冰冰 王慧君 周文浩

Russel-Silver综合征(RSS，OMIM#180860)也称Silver-Russel综合征(SRS)，是一组临床和遗传异质性疾病，主要临床表现为胎儿严重宫内及出生后生长发育迟缓、身材矮小和特殊面容等[1-3]。RSS是表观遗传性疾病的典型代表，患儿中30%～60%有父源染色体11p15区H19差异甲基化区域(H19-DMR)也称为印记中心区1(ICR1)低甲基化，5%～10%有7号染色体母源单亲二倍体[UPD7(mat)],30%～40%病因不明[3-6]。RSS临床诊断主要依靠临床评分系统和分子基因检测，分子遗传学检测明确H19-DMR低甲基化或UPD7(mat)可确诊RSS。甲基化特异性多重链接探针扩增技术(MS-MLPA)可以同时检测11p15区域的甲基化水平和该区域的拷贝数变异(CNV)，且经济实用，在RSS的H19-DMR低甲基化检测中最常用。本文回顾性分析复旦大学附属儿科医院(我院)分子医学中心近年来基于MS-MLPA技术确诊的RSS患儿的临床特征和基因型特点，并对表型-基因型的相关性进行分析，以期为临床早期分子诊断RSS提供借鉴。

1 方法

1.1 RSS的临床诊断标准 符合以下2个临床评分系统中的任何一个。Lai等标准[7]，满足以下3/5条：①出生体重≤-2SD，②与同龄儿童相比身高≤-2SD，③颅面部典型特征，④四肢或身体或面部不对称，⑤指弯曲。Azzi等标准[8]，满足以下4/6条：①小于胎龄儿(SGA)，出生体重或出生身长≤-2SD，②出生后生长迟缓，与同龄儿童相比身高≤-2SD，③出生时相对大头(头围≥1.5 SD，大于出生体重/身长SD值)，④身体不对称，⑤喂养困难或BMI≤-2SD，⑥1～3岁时前额突出。

1.2 病例纳入标准 2015年1月1日至2019年6月30日在我院分子医学中心经MS-MLPA确诊的RSS连续病例。

1.3 MS-MLPA检测 在取得患儿家长知情同意后，采集患儿外周静脉血样本。采用德国QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)全血试剂盒及其标准DNA抽提方法提取基因组DNA(gDNA)，并测定其浓度(美国Thermofisher公司NanoDrop紫外分光光度仪)。用MS-MLPA试剂盒(SALSA MS-MLPA probemix ME030-C3 BWS/RSS，MRC，Holland)检测患儿及正常对照人类(美国Agilent公司,货号5190-3796)的11p15区域甲基化水平和该区域的CNV情况，按照试剂盒说明书操作，实验主要步骤包括DNA变性、杂交、链接、PCR扩增和毛细管电泳分析(ABI3130)。该试剂盒涉及11p15区域2个甲基化差异性表达的区域H19-DMR和Kv-DMR(也称为印记中心区2，ICR2)，包含检测H19-DMR和Kv-DMR的探针各4个，待测区域均含有HhaⅠ酶识别位点。应用GeneMarker软件对实验数据进行均一化处理及结果分析，在判断基因CNV情况时将0.7～1.3的峰比值作为正常参考范围；在判断甲基化水平时将待测区域酶切后探针信号峰值较酶切前减少50%作为正常参考范围。

1.4 资料截取 从医院病历系统中截取患儿的年龄、性别，初诊原因，胎儿期发育情况，出生情况，就诊时身高、体重，面部特征，有无肢体不对称或其他发育异常，生长激素水平，骨龄等。

2 结果

2.1 一般情况 经MS-MLPA检测确诊的19例RSS患儿进入本文分析(表1)，女8例，男11例，中位确诊年龄3.3岁(3个月至10岁)。就诊原因：身材矮小9例，生长发育迟缓5例，生长发育迟缓合并身材矮小3例，肢体不对称2例。3例(例13、16和17)孕期B超记录均提示胎儿发育迟缓。出生时18例评估为SGA；1例足月出生，体重正常。就诊时，除例1无身长和体重记录外，余18例身高和体重均分别低于同龄儿童身高P3和P10。8例行骨骼X线检查，7例提示骨龄落后，平均落后骨龄为2.3(1.5～3)岁；例2骨龄提前1.5岁。前额突出9例，三角脸7例，手指短或内侧弯曲6例，小下颌5例。其他表现包括眼距宽、低耳位、高腭弓、牙齿突出、胸廓畸形、脊柱侧凸和房间隔缺损等。肢体不对称6例，其中4例为肢体长度和粗细存在差异，2例仅表现为肢体粗细不对称。9例患儿初诊时检测了生长激素(GH)水平，均为GH缺乏。

2.2 MS-MLPA检测结果 表1显示，3例(例2、3和19)为11p15区域重复合并H19-DMR低甲基化和Kv-DMR高甲基化，余16例为H19-DMR低甲基化(其中例1 Kv-DMR也呈低甲基化)。图1为患儿MS-MLPA检测结果判断图。

2.3 表型-基因型相关性分析 3例携带11p15区域重复合并H19-DMR低甲基化和Kv-DMR高甲基化，考虑为母源11p15区域片段重复；3例均有SGA、出生后生长发育迟缓、身材矮小和低体重，前额突出和三角脸各1例。16例检测到H19-DMR低甲基化，但未检测到CNV，为父源H19-DMR甲基化丢失所致；出生后生长发育迟缓、身材矮小和低体重16例，SGA 15例，前额突出8例，三角脸、肢体不对称、手指短或内侧弯曲和小下颌各6例。

3 讨论

目前全世界报道RSS病例约400例[1]，国内多为个案报告，样本量大于10例的报道仅见巩纯秀等在2013至2014年基于临床评分系统诊断的RSS，其中8例确诊存在11p15印记缺陷[9,10]。

经MS-MLPA确诊H19-DMR低甲基化的RSS大宗病例系列报告，本文19例、日本[11]43例、英国和荷兰[12]44例，3个中心的RSS患儿出生体重≤-2SD分别为94.7%、100%和81.8%；身材矮小(≤-2SD)的发生率分别为100%(18/18)、82.5%(29/35)和56.8%，前额突出分别为47.4%、83.8%(31/37)和59.1%；三角脸分别为36.8%、97.7%和

表1 19例RSS患儿的临床特征和MS-MLPA检测结果

注 SGA：小于胎龄儿；-：未做或不适用；1)：出生时；2)：生长激素参考范围：1.0～48.8 ng·mL-1；3：H19-DMR低甲基化:4：Kv-DMR高甲基化:5：11p15区域重复:6：Kv-DMR低甲基化59.1%；身体不对称分别为31.6%、81.1%(30/37)和68.2%；手指短或内侧弯曲分别为31.6%、78.4%(29/37)和75%；小下颌分别为26.3%、未统计和63.6%。均满足Lai等[12]中的3/5条标准或Azzi等[13]4/6条标准。

2017年第一个关于RSS诊断和管理的专家共识[3]发布，指出RSS的诊断需要临床评分系统和分子基因检测相结合，但分子基因检测结果可作为确诊依据。MS-MLPA是检测甲基化水平较经典的方法。该技术可通过HhaⅠ酶识别甲基化位点，通过比较酶切前后探针信号的比值可同时进行11p15区域基因CNV和甲基化水平的检测，并且具有成本效益，经济实用，可广泛应用于临床。同时，由于11p15区域H19-DMR低甲基化为RSS的主要病因(30%～60%)。因此，对临床怀疑RSS的患儿进行MS-MLPA检测是首选。本文通过MS-MLPA确诊了19例RSS患儿。但是，MS-MLPA也有局限性(探针数目和检测位点相对固定)，该方法不能检测探针结合位点之外的其他位点的甲基化水平，缺乏灵活性，对于MS-MLPA检测阴性的患儿也应考虑进一步进行甲基化芯片、基因组CNV或候选基因变异等相关检测，以免漏诊。本文所涉及的患儿仅针对11p15区域甲基化水平和该区域的CNV情况进行了检测，未明确基因诊断的患儿尚需进一步的分子遗传学研究。

目前已报道多种染色体异常与RSS相关，包括染色体1、2、7、8、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22和X[13,14]。本文19例RSS患儿均为H19-DMR低甲基化，其中3例携带11p15区域片段重复和Kv-DMR高甲基化，考虑为母源11p15区域重复导致。这是由于11p15印记区域包括H19-DMR(由H19/IGF2基因构成，父源为甲基化状态)和Kv-DMR(由KCNQ1OT1/CDKN1C基因构成，母源为甲基化状态)。IGF2基因是胰岛素样成长因子2，编码胚胎生长因子，只有在H19-DMR处于甲基化状态时才表达。CDKN1C基因编码一种细胞增殖的负调节因子-细胞周期依赖性激酶抑制剂1C(CHKN1C蛋白)，是一种抑癌基因，在Kv-DMR处于甲基化状态时CDKN1C基因表达。正常情况下IGF2和CDKN1C基因各有一个拷贝表达。当母源11p15区域片段重复时，患者有2拷贝的母源非甲基化和1拷贝的父源甲基化H19-DMR，导致了H19-DMR甲基化相对降低，但此时IGF2基因表达正常。相反，患者遗传了2拷贝的母源甲基化和1拷贝的父源非甲基化Kv-DMR，导致了Kv-DMR甲基化相对升高，此时CDKN1C基因表达增加。CDKN1C基因过表达可能是患者出现RSS表型的原因[15-17]。携带与不携带11p15区域重复的RSS患儿，虽然为两种不同发病机制(父源H19-DMR甲基化丢失和母源11p15区域重复)，但在RSS主要临床表现差别不大。例1为H19-DMR和Kv-DMR均低甲基化，H19-DMR低甲基化导致了RSS表型的出现，而Kv-DMR低甲基化可导致抑癌基因CDKN1C基因表达下调，肿瘤发生风险相对增高[18]，后续应对患儿进行肿瘤相关监测。

图1 RSS患儿MS-MLPA探针信号酶切前后结果判读

注 A列为酶切前探针信号的峰值图，B列为酶切后探针信号峰值图。图A-1和B-1显示H19-DMR低甲基化且无CNV情况(例4～18)；图A-2和B-2提示11p15区域重复合并H19-DMR低甲基化和Kv-DMR高甲基化(例2、3和19)；图A-3和B-3提示H19-DMR和Kv-DMR均低甲基化，未检测到CNV情况(例1)

对临床怀疑RSS的患儿，早期进行基因检测，可以为实现疾病早诊断、早治疗提供可能，改善患儿预后。大多数RSS患儿，尤其是5岁以下的患儿存在喂养困难，营养不良的问题，这些均增加了空腹低血糖和对神经认知损害的风险。据统计RSS患儿低血糖的发生率约为27%，而自发的夜间低血糖的发生更频繁[3]。因此，对拟诊RSS患儿早期进行基因检测，明确诊断，及早开始营养支持治疗和预防低血糖的发生十分必要。身材矮小是RSS的一个重要特征，有文献报道重组人GH替代治疗可改善RSS患儿的最终身高。Toumba等[19]和Binder等[20]分别对RSS患儿进行了长达10年和6年的GH跟踪治疗，发现患儿最终身高有了显著改善，并且治疗开始时身高越矮，终身高的改善越显著，治疗效果与治疗时间相关。故明确诊断RSS，可以指导临床对成长发育进行监测，尽早评估是否需进行GH治疗，改善患儿成年期身高。另外，运动和语言发育迟缓在RSS患儿中比较常见，发生率分别为37%和40%[3]。因此，早期诊断可以实现对RSS患儿及早进行发育评估，进行及时适当的干预与康复训练。对于肢体明显畸形的患儿，可尽早评估是:否进行手术矫形。

RSS多为散发病例，具有多重病因，一般不做产前诊断。但是，对于具有RSS阳性家族史的家庭，对先证者进行基因检测明确诊断可以为患儿家庭进行遗传咨询和产前诊断提供依据。若患儿母亲再次生育时应在孕期密切监测胎儿是否有宫内发育迟缓，肢体不对称，相对大头等表现，警惕该病的发生，必要时应进行产前诊断，实现优生优育。