外源性催产素在周围神经系统中的镇痛作用研究

罗雅范，韩毅，邸畅，李国萍，陈绍春，5*

本研究价值：

本研究证明了外源性催产素能有效缓解大鼠的炎症性疼痛，降低外周血和炎性组织中前列腺素E2水平，并初步揭示了外源性催产素可能通过抗炎和减少致痛因子而在周围神经系统发挥镇痛作用，为临床镇痛治疗提供了新的思路。但对慢性疼痛的镇痛效果及长期反复使用催产素的潜在负面效应还有待进一步研究。

疼痛是一种令人不愉快的感觉以及情绪上的感受，伴或不伴有实质上或潜在的组织损伤。各种损伤刺激通过感觉神经纤维传入脊髓，最后到达大脑皮质感觉区而引起疼痛，是一种多维度体验（包括情感、认知等多方面），严重影响患者的生活质量。炎性疼痛主要由组织损伤后释放的炎性因子（同时也是致痛因子）引起，这些致痛因子是疼痛的主要病理基础。致痛因子主要由巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞等释放，包括促炎因子、前列腺素类（PG）、缓激肽（BRK）等，其中前列腺素E2（PGE2）是这些递质中最重要的致痛因子之一［1］。

催产素主要是由下丘脑视上核和室旁核的神经元合成的一种垂体肽类激素，除了具有使妊娠末期子宫收缩和促进哺乳期排乳的作用外，其在镇痛方面的作用正日益引起人们的关注［2］。催产素受体属于G蛋白耦联受体，在催产素与受体结合后，可以激活蛋白激酶C（PKC）、磷脂酶C（PLC）等系统，并通过升高内源性Ca2+浓度等途径产生一系列生物学效应［3］。研究显示，催产素具有神经递质和激素的双重作用，在中枢神经系统（CNS）作为神经递质参与大脑的重要功能，如社会行为、情感处理等［4］。催产素作为神经激素主要通过脑垂体后叶的轴突终端释放入血以到达全身各个系统，在血液循环中主要以自由肽的形式存在。MIRANDACARDENAS等［5］在大鼠中发现一个新的催产素能通路，这条通路起源于室旁核（PVN），投射到脊髓背角，该条神经通路被证实在损伤性刺激中参与痛觉信息传递的调控。亦有研究证实催产素在CNS有镇痛作用，包括在脊髓水平发挥抗痛觉过敏的作用［6］。虽然催产素已被证实有镇痛作用，但多为分析其在CNS中的镇痛作用，而在周围神经系统中的镇痛作用鲜有报道。且CHOW等［7］研究表明，人类脑脊液和血液中的催产素含量不相关，说明周围神经系统和CNS的催产素池是两个独立的部分，即催产素不能通过血-脑脊液屏障。

角叉菜胶是从海藻中提取的含硫酸多糖物质，可用于制备多种组织炎症模型。角叉菜胶导致的大鼠足底肿胀模型是一个常用于评价或筛选药物抗炎作用的经典模型，当给大鼠足掌内注射少量角叉菜胶时能引起大鼠足部明显疼痛，并伴有局部毛细血管扩张、血管通透性增高、渗出、水肿等一系列类似于人体急性炎症的反应［8］。因此，本研究拟通过采用角叉菜胶注入大鼠足掌构建炎性疼痛模型，给予外源性催产素，通过热板、压板试验检测催产素的镇痛效果，通过测量大鼠足掌肿胀程度检测催产素的抗炎作用，并检测周围神经系统致痛因子PGE2的变化情况，分析催产素在周围神经系统的镇痛作用，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物、试剂和仪器 催产素（深圳市豪地华拓生物科技有限公司，中国），催产素ELISA试剂盒、PGE2 ELISA试剂盒（伊莱瑞特生物科技股份有限公司，中国），低温高速离心机（Eppendorf，德国），电热三用超级热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，中国），酶标仪（Thermo，美国）。

1.2 实验动物及分组 2017年3月—2018年1月，40只清洁级成年SD雄性大鼠购自昆明医科大学实验动物学部，体质量180～220 g。将SD大鼠随机分为5组（各8只）后进行造模。（1）对照组（NOR组）：不进行任何处理；（2）模型组（INF组）：右后足足掌部注射角叉菜胶0.1 ml/只；（3）安慰治疗组（NS组）：右后足足掌部注射角叉菜胶0.1 ml/只，随后即刻腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.5 ml/只；（4）催产素治疗组（OT组）：右后足足掌部注射角叉菜胶0.1 ml/只，随后即刻腹腔注射催产素0.5 ml/只（50 μg/kg）；（5）阳性对照组（ASP组）：右后足足掌部注射角叉菜胶0.1 ml/只，随后即刻腹腔注射阿司匹林0.5 ml/只（250 mg/kg）。角叉菜胶注射顺利、无溢出为造模成功。除NOR组外，其余4组均造模成功，无死亡及特殊损伤情况。

5组大鼠在造模4 h后进行行为学检测、肿胀程度检测、采血等。

1.3 实验方法

1.3.1 采用热板实验测量大鼠造模前后热板潜伏时间（HPL） 热板温度保持在（52.0±0.1）℃，以HPL为其痛阈指标，即大鼠右后足接触热板至其离开热板的时间。

1.3.2 采用压板试验测量大鼠造模前后后足缩足潜伏期（HWL） 将大鼠右后足平放在压板测量计上，使压板测量计上可滑动的平钝活塞刚好挨着大鼠右后足背侧的皮肤（跗跖关节）处，再开始使用压力测痛仪对大鼠进行压力测试，当大鼠右后足从压板上后撤时记为大鼠的HWL。

1.3.3 后足足周长及后足肿胀程度检测 分组后先由同一人用棉绳测量大鼠右后足中部横向周长，以足掌面中心处为中心绕其1周，作为基础初始周长。当各组造模4 h后，再按照相同的方法测量其周长。后足肿胀程度=（造模4 h后后足周长-初始后足周长）/初始后足周长 ×100%［9］。

1.3.4 采用ELISA法检测外周血血清催产素、PGE2水平及炎性组织PGE2水平 10%水合氯醛麻醉后，采用摘眼球法采血，将血液收集于无热源、无内毒素的试管，随即放入 4 ℃冰箱静置 30 min，1 000 r/min 离心 15 min（离心半径为7.2 cm），取上清液待测。取完血液样本后，将大鼠右后足剪下，迅速将组织分离成适宜的小块，按1∶9的体积加入预冷的匀浆缓冲液，冰浴下高速匀浆机匀浆，匀浆液 5 000 r/min离心 10 min（离心半径为8.4 cm），取上清液待测。后续按照ELISA试剂盒操作流程进行操作，检测外周血血清催产素、PGE2水平及炎性组织PGE2水平。

1.4 统计学方法 采用PRISM 6.0软件进行统计学分析。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组 大 鼠HPL比较 5组大鼠造模前HPL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；5组大鼠造模4 h后HPL比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。造模4 h后，INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠HPL均短于NOR组，差异有统计学意义（P＜0.05）；OT组、ASP组大鼠HPL长于INF组、NS组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NS组大鼠HPL与INF组比较、OT组大鼠HPL与ASP组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。NOR组大鼠造模前后HPL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠造模4 h后HPL均短于本组造模前，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组 大 鼠HWL比较 5组大鼠造模前HWL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；5组大鼠造模4 h后HWL比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。造模4 h后，INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠HWL短于NOR组，差异有统计学意义（P＜0.05）；OT组、ASP组大鼠HWL长于INF组、NS组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NS组大鼠HWL与INF组比较、OT组大鼠HWL与ASP组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。NOR组大鼠HWL造模前后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠造模4 h后HWL均短于本组造模前，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠HPL比较（x± s，s，n=8）Table 1 Comparison of HPL among NOR，INF，NS，OT and ASP groups

2.3 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠造模前后后足周长及后足肿胀程度比较 5组大鼠造模前后足周长比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；5组大鼠造模4 h后后足周长、后足肿胀程度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。造模4 h后，INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠后足周长长于NOR组，差异有统计学意义（P＜0.05）；OT组、ASP组大鼠后足周长短于INF组、NS组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NS组大鼠后足周长与INF组比较、OT组大鼠后足周长与ASP组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。OT组、ASP组大鼠后足肿胀程度小于INF组、NS组，差异有统计学意义（P＜0.05）；NS组大鼠后足肿胀程度与INF组比较、OT组大鼠后足肿胀程度与ASP组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

2.4 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠外周血血清催产素、PGE2水平比较 5组大鼠外周血血清催产素、PGE2水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。INF组、NS组大鼠外周血血清催产素、PGE2水平高于NOR组，差异有统计学意义（P＜0.05）；OT组、ASP组大鼠外周血血清催产素、PGE2水平与NOR组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；INF组与NS组、OT组与ASP组大鼠外周血血清催产素、PGE2水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表4）。

2.5 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠炎性组织PGE2水平比较 5组大鼠炎性组织PGE2水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。INF组、NS组大鼠炎性组织PGE2水平高于NOR组，差异有统计学意义（P＜0.05）；OT组、ASP组大鼠炎性组织PGE2水平与NOR组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；INF组与NS组、OT组与ASP组大鼠炎性组织PGE2水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表5）。

3 讨论

在镇痛机制上，通常认为非麻醉性镇痛药（如阿司匹林）主要作用于外周感受器，而麻醉性镇痛药（如吗啡等）主要作用于CNS。躯体疼痛时，临床医生通常采用阿片或阿片类镇痛药，但这些药物会产生严重的成瘾性和依赖性。阿司匹林是常用的外周镇痛药，但胃肠道方面的不良反应比较明显。研究发现，神经肽（如甘丙肽和降钙素基因相关肽等）在中枢水平参与了对大鼠的镇痛作用，而催产素也是一种小分子肽，并且是哺乳动物自然分泌的一种神经肽，可以避免阿片类药物的成瘾性、阿司匹林的胃肠道反应，所以研究催产素的镇痛作用及机制具有十分重要的临床意义［10］。

表2 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠HWL比较（x± s，s，n=8）Table 2 Comparison of HWL among NOR，INF，NS，OT and ASP groups

表3 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠造模前后后足周长及后足肿胀程度比较（x ±s，n=8）Table 3 Comparison of circumference and swelling degree of right hind paw berore and after treatment among NOR，INF，NS，OT and ASP groups

表4 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠外周血血清催产素、PGE2水平比较（x±s，n=8，pg/ml）Table 4 Comparison of oxytocin and PGE2 levels in peripheral blood of NOR，INF，NS，OT and ASP groups

表 5 NOR组、INF组、NS组、OT组、ASP组大鼠炎性组织PGE2水平比较（x ±s，n=8，pg/ml）Table 5 Comparison of PGE2 levels in the inflammatory tissue of NOR，INF，NS，OT and ASP groups

研究表明，侧脑室内注射催产素会激活下丘脑内室旁核或视上核的催产素受体，而下丘脑视上核与大脑内参与镇痛的核团，如中缝大核、蓝斑、中脑导水管周围灰质以及脊髓背角等均有非常密切的关系［11］。痛刺激可以引起CNS内许多部位催产素含量发生不同程度的变化，电针刺激双侧足三里后，脊髓内催产素含量明显增加，侧脑室内注射催产素也可缓解疼痛［12］。HAN等［13］研究表明，脊髓背角不仅有来自视上核和室旁核的催产素能神经纤维末梢，也存在催产素能突触的特殊结合位点。这些研究均说明催产素确实可在CNS参与疼痛调制而发挥镇痛作用。

既往研究表明，周围神经系统和CNS的催产素池是两个独立的部分，催产素不能透过血-脑脊液屏障［14］，那么催产素是如何在周围神经系统发挥镇痛作用呢？本研究通过大鼠足掌部注射角叉菜胶构建炎性疼痛模型，给予外源性催产素镇痛，经热板实验和压板试验检测证实外源性催产素也具有明显的镇痛效果。

有研究认为，炎性部位释放的趋化因子可吸引白细胞的移动，而后者释放的大量细胞因子，包括前列腺素类、缓激肽等，形成复杂的炎症级联反应，导致系统炎性反应的发生［15］。炎症表现包括红、肿、热、痛和功能障碍，其中肿胀是炎性部位的一种基本变化，并且是急性炎症的标志性变化之一，因此对肿胀的抑制程度也可以反映药物的抗炎作用［16］。大量研究表明，细胞因子包括PGE2等在急性炎症的发病过程中起到非常重要的作用，研究细胞炎性因子的水平变化可以作为评价并预测炎症严重程度的指标，而血清或组织液中细胞炎性因子水平的变化可以在一定程度上反映药物的治疗效果［17］。PGE2受体激活可导致外周伤害感受器中PKC和PKA的活化，继而激活多个分子，包括瞬态电压感受器阳离子通道1（TRPV1）通道、嘌呤能P2X3受体、Ca2+通道，然后激活电压门控钠通道，导致炎性痛觉过敏［18］。本研究通过对大鼠足掌皮下注射1%角叉菜胶成功诱发了局部急性炎性疼痛，结果显示，INF组、NS组大鼠外周血血清、炎性组织PGE2水平高于NOR组；血液和炎性组织PGE2水平均明显升高，提示疼痛和肿胀主要与该部位PGE2水平升高有关。INF组与NS组、OT组与ASP组大鼠外周血血清、炎性组织PGE2水平间无差异，表明经外周给予催产素后，血液和炎性组织PGE2水平均明显下降，炎性部位的肿胀程度也明显缓解，提示外源性催产素可能通过减少炎性部位的PGE2水平、减轻肿胀程度而发挥镇痛作用。

此外，催产素作为一种可由自身产生的神经递质，其安全性自然是可靠的。既往研究已充分证明疼痛刺激可引起CNS内催产素含量增加，并且可通过多条神经通路将催产素输送到脑的不同区域以及脊髓参与痛觉信息的调制，从而发挥中枢镇痛作用［19］，这是哺乳动物个体自主自发的一种镇痛机制。但临床上要将外源性催产素注射到CNS以达到镇痛的目的，有较大的技术难度，也存在较高的风险。

综上所述，外源性催产素镇痛作用明显，其能降低外周血和炎性组织中PGE2水平，缓解炎性部位的肿胀程度，说明其可能通过抗炎和减少致痛因子进而在周围神经系统发挥镇痛作用。本研究初步揭示了催产素在周围神经系统发挥镇痛作用的可能机制，为临床镇痛治疗提供了新的思路和策略。

作者贡献：陈绍春进行文章的设计、研究的可行性分析、论文修改，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责；韩毅进行文章的构思；罗雅范、邸畅、李国萍进行研究的实施；罗雅范进行数据收集、整理、统计学分析和论文撰写。

本文无利益冲突。