拟南芥IbbHLH家族基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

樊玲玲 马铭悦 韩毅

摘要 [目的]全氟辛酸（PFOA）处理能显著诱导拟南芥Ib bHLH（Ib basic helixloophelix）家族4个转录因子bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的转录水平。为了进一步分析这4个基因在响应PFOA中的潜在作用，利用CRISPR/Cas9技术构建了它们的共敲除载体。[方法]以野生型拟南芥基因中的外显子为模板，设计引物，通过两步PCR扩增法将靶向基因连接到CRISPR/Cas9载体上;将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性菌落，PCR鉴定正确后，将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中，再次挑取阳性菌落进行PCR鉴定正确后，提取质粒进行表达盒测序。[结果]通过两步PCR扩增法，成功将4个靶点表达盒转入到CRISPR/Cas9载体中，构建了bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的双元CRISPR/Cas9敲除载体。[结论]成功构建的Ib BHLH家族CRISPR/Cas9敲除载体，为后续拟南芥Ib BHLH家族四突突变体材料的获得提供了可用性载体。

关键词 拟南芥;Ib BHLH家族基因;载体构建;CRISPR/Cas9

中图分类号 Q945.78文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）19-0118-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.035

Abstract [Objective]Perfluorooctanoic acid （PFOA） treatment significantly induced the transcription levels of the Ib bHLH（Ib basic helixloophelix） family four transcription factors bHLH38， bHLH39， bHLH100 and bHLH101 of Arabidopsis thaliana. To further analyze the potential role of these four genes in response to PFOA， we used the CRISPR/Cas9 technology to construct their coknockout vector. [Method]Primers were designed using exons in the wildtype Arabidopsis thaliana genes as a template， and the target genes were ligated to the CRISPR/Cas9 vector by twostep PCR amplification. The successfully constructed recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH5α， positive colonies were picked. After PCR identification， the plasmid was extracted and transferred into Agrobacterium GV3101 receptive cells， positive colonies were picked again for PCR identification. The plasmid was extracted and sequenced. [Result]Four target expression cassettes were successfully transferred into the CRISPR/Cas9 vector by twostep PCR amplification， and a binary CRISPR/Cas9 knockout vector of bHLH38， bHLH39， bHLH100 and bHLH101 was constructed. [Conclusion]The successfully constructed Ib BHLH family CRISPR/Cas9 knockout vector provides an availability vector for the subsequent Arabidopsis thaliana Ib BHLH family of tetramer mutant materials.

全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是一种人工合成化合物，被广泛应用于如油漆、纺织品和化妆品在内的各种工商业产品中。PFOA的持续使用和大量排放使其越来越多地分布于环境中。目前，几乎在所有环境和生物基质中都能检测到其存在[1]。环境中存在的PFOA可以经过水体和土壤进入植物，在植物体内进行富集。目前，已经在小麦、土豆、胡萝卜等多种作物体内发现了PFOA的积累[2-3]。植物体内高浓度的PFOA会造成严重的生长和发育毒害[3-5]，但其毒性作用机制目前尚不清楚。采用模式植物拟南芥对PFOA造成的毒性作用机制进行分析，发现PFOA会强烈诱导拟南芥bHLH Ib亚族所有4个转录因子bHLH38、bHLH39[6]、bHLH100和bHLH101[7]的表达。

Ib亚族的4个bHLH转录因子在铁稳态中发挥重要作用，在缺铁条件下，至少有1个与FIT形成二聚体，才能激活铁吸收相关蛋白FRO2和IRT1的表达，促进植物根部对铁的吸收[8]。在拟南芥的研究中发现，以上4个转录因子中任何一个基因的突變都不会对植物生长造成影响，但是bHLH38与bHLH100/bHLH101及bHLH39与bHLH100/bHLH101的双基因或三基因突变，会使拟南芥出现小化和黄化的症状[9]。拟南芥bHLH38和bHLH39由于连锁，所以无法通过传统杂交手段获得四突突变体。

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