苦荞麦总黄酮对２型糖尿病大鼠胰岛素信号转导通路中ＧＳＫ－３β、ＡＫｔ相关基因与蛋白表达的影响

马小敏 蔡芮桐 高铭阳

【摘 要】 目的：观察苦荞麦总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛素信号转导通路中GSK-3β与AKt基因与蛋白表达情况的影响。方法：雄性wistar大鼠链脲佐菌素诱导建立T2DM 模型，将T2DM模型大鼠随机分为5组：模型组、苦荞麦总黄酮低剂量组（50 mg/kg）、苦荞麦总黄酮中剂量组（100 mg/kg）、苦荞麦总黄酮高剂量组（200 mg/kg）、西药组（二甲双胍100 mg/kg），另外设置对照组。灌胃给药后，采用ELISA法测胰岛素水平、血糖水平，计算胰岛素敏感指数;采用RT-PCR法检测大鼠肝组织中GSK-3β、Akt的mRNA表达情况;采用Western-blot法测定大鼠肝组织中GSK-3β、AKT的蛋白表达情况。结果：与模型组相比，苦荞麦总黄酮可降低大鼠肝组织中GSK-3βmRNA和蛋白表达（P<0.05）、增加Akt mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结论：苦荞麦总黄酮能降低模型大鼠肝组织中GSK-3βmRNA和蛋白表达、增加Akt mRNA和蛋白表达进而起到积极的影响作用。

【关键词】 苦荞麦总黄酮;2型糖尿病;胰岛素信号转导通路;糖原合成激酶-3β;蛋白激酶B

【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2019）18-0015-07

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种发病率极高的代谢性疾病，已严重影响人类生活。据国际糖尿病联盟（the International Diabetes Federation，IDF）发布的第八版全球糖尿病地图数据显示，2017年全球共有4.25亿糖尿病患者，其中中国患病人数最多[1]，90%～95%为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）[2]。T2DM的病理机制与胰岛β细胞功能失常和胰岛素抵抗关系十分密切，其在环境、遗传等因素的影响下通常表现为胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）[3]。糖原合成激酶-3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）是胰岛素受体信号转导通路中一个关键节点，它在细胞中过度表达会引起胰岛素信号转导受阻，引起IR[4-7]，有实验表明抑制GSK-3β活性可改善小鼠的糖耐量水平，使肝糖原代谢增加进而增加肝糖原含量[8]。在胰岛素信号转导通路中，激活的蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）可使GSK-3β磷酸化从而失活达到降血糖的目的。因此，促进Akt表达从而抑制GSK-3β可以减轻胰岛素抵抗，改善糖耐量水平，产生潜在的抗糖尿病效果[9]。

苦荞麦作为一种药食两用的植物，在国内外被广泛种植[10]。其黄酮类化合物在医药保健方面具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力及保护心脑血管等多种功效[11-12]。研究通过观察苦荞麦总黄酮对Ⅱ型糖尿病胰岛素信号转导通路中GSK-3β和Akt基因与蛋白的表达情况的影响，测定各组大鼠肝组织中mRNA与蛋白含量，探讨苦荞麦总黄酮对Ⅱ型糖尿病影响的作用与机制。

1 实验材料

1.1 動物与饲料 SPF级wistar大鼠78只，雄性，许可证号SCXK（辽）2015-0001 辽宁长生生物技术有限公司。高脂饲料和普通饲料（沈阳市于洪区前民动物实验饲料厂）;猪油和蔗糖（沈阳市和平区金味源食品批发部）。

1.2 药品与试剂 苦荞麦总黄酮（日本三益制药株式会社，含量为991.65 mg/g）;二甲双胍（批号：20150617，沈阳维康医药连锁有限公司）;链脲佐菌素（批号：1122F032，solarbio）;胰岛素ELISA试剂盒;氯仿、异丙醇、无水乙醇（20150607）国药集团化学试剂有限公司;RT-PCR试剂盒（AK5701），核酸Marker（A801A），上、下游引物（CHPA194）; SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：20151222，Solarbio）;NC膜（批号：T426062，Pall）;TBS缓冲剂（批号：60900120）、蛋白ladder（批号：69J00157）购自北京鼎国公司; SDS-PAGE电泳粉（批号：20161111）、BCA蛋白含量检测试剂盒（批号：20160629）购自凯基生物;蛋白提取试剂盒（批号：20160622）， GSK-3β（批号：0003）、Akt（批号：0020）、GAPDH（批号：0010）均为CST公司;HRP标记抗兔二抗（批号：0026，CST公司）。

1.3 仪器 ACCU-CHEK血糖仪（罗氏诊断产品有限公司）;ACCU-CHEK血糖试纸（罗氏诊断产品有限公司）;iMark酶标仪（美国BD）;JD500-3电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）;DW-HL388超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）;HR/T20M台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）;HE-90水平电泳槽、VE-180垂直电泳槽均为上海天能科技有限公司;S1000 Thermal Cycler梯度PCR仪（BIO-RAD）;Chemi XR5凝胶成像分析仪;化学发光仪。

2 方法

2.1 试剂配制

2.1.1 链脲佐菌素（STZ）注射液 将柠檬酸（2.585 g）、柠檬酸三钠（2.265 g）用150 mL三蒸水溶解，用HCL调pH至4.2后用三蒸水定容至200 mL，4℃储存。使用时加STZ配成浓度为2%STZ溶液，注意用滤膜除菌。

2.1.2 Western blot缓冲液的配制

2.1.2.1 TBS存储液 粉剂常温存放，使用时直接用纯水稀释成1 L的存储液。

2.1.2.2 TBST洗液 由1L TBS存储液加入0.5 mL吐温混匀制成。

2.1.2.3 转膜液 配转膜液由粉剂在配液时加热，并用纯水定容至800 mL，再加200 mL甲醇混匀而成。

2.1.2.4 封闭液 封闭液浓度为5%，即用5 g奶粉加100 mL纯水制成。

2.2 动物模型建立 雄性wistar大鼠于动物实验中心适应性喂养（猪油及蔗糖）3 d后，随机分为两组：对照组（普通饲料）7只，高脂饲料组（高脂饲料）71只（分笼饲养，每笼7只），喂养8周。喂养8周后，高脂饲料组按体质量筛选出成为食源性肥胖的大鼠（标准：高脂饲料组个体质量≥对照组个体质量均值+2倍标准差）后，继续喂养4周。空腹状态下用氧化酶法测定各组大鼠血糖;同时眶静脉取血，用ELISA法检测胰岛素水平。计算胰岛素敏感指数（ISI）=1/（FINSxFBG）（FINS为空腹胰岛素，FPG为空腹血糖）。将对照组与高脂饲料组进行对照，筛选建立高脂饲料组大鼠胰岛素抵抗模型。建模后对高脂饲料组大鼠进行连续2周腹腔注射链脲佐菌素，剂量为25 mg/kg·周。再次测量空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L视为造糖尿病模型造模成功[13-14]。

2.3 动物分组 除对照组外，将糖尿病造模成功大鼠随机分5组，分别为模型组7只;4个用药组分别为苦荞麦总黄酮低剂量组7只（用药量50 mg/kg）;苦荞麦总黄酮中剂量组7只（用药量100 mg/kg）;苦荞麦总黄酮高剂量组7只（用药量200 mg/kg）;西药组7只（二甲双胍100 mg/kg）。灌胃给药4周后，再次眶静脉取血后处死各组大鼠，提取肝组织。

2.4 指标测定及方法 给予高脂饲料8周后测量大鼠体重;给予大鼠注射STZ前，用ELISA法和氧化酶法分别测量大鼠的胰岛素和血糖水平，并计算胰岛素抵抗指数。具体方法：准备96孔加样板，试剂盒室温平衡30 min后，将样品和标准品、生物素标记二抗和酶标试剂，置于37℃水浴中反应60 min;洗板5次，加入试剂盒中显色液A 50μL和B 50 μL，37℃水浴中反应10 min;加入终止液50 μL后于10 min内放入酶标仪450 nm波长下读取OD值并计算;给予注射STZ 2周后用ELISA法测胰岛素水平和血糖水平，并计算胰岛素抵抗指数。方法同前。

2.4.1 RT-PCR法检测大鼠肝组织中GSK-3β、Akt的mRNA表达情况

2.4.1.1 分离RNA 于冰盘上取100 mg大鼠肝组织，用预冷生理盐水冲洗后剪碎，放入匀浆器内，加入1 mL Trizol试剂匀浆裂解细胞。静止5 min后，转移裂解液到EP管中，加入0.2 mL氯仿，剧烈摇动混匀。4℃静置5 min后、12 000 rpm离心15 min。用移液器将水相转移到新管中，加入等体积异丙醇混匀，静置10 min。再次4℃、12 000 rpm离心10 min。去上清，加入1 mL 75%乙醇混匀，静置5 min。第3次4℃、 1 2000 rpm离心5 min。分离出RNA，倒掉乙醇，静置5 min后加入30μL DEPC水溶解，得到RNA溶液。取12μL RNA溶液，加入 DEPC 水稀释，用酶标仪测定260 nm 和280 nm的吸光度，并计算RNA的浓度和纯度。

2.4.1.2 反轉录出mRNA 按TAKARA试剂盒说明书要求配制10μL反转录体系，于PCR仪中42～60℃条件下放置15～30 min，95℃条件下5 min，5℃条件下5 min;再配制PCR反应液40μL，把此反应液加入到反转录反应结束的PCR反应管中，轻轻混匀，离心约10s，进行PCR反应：94℃进行30sec，55～65℃进行30sec，上述两步骤重复30Cycles，然后72℃进行50sec。准备上样。在上述RT-PCR过程中用到的上、下游引物及合成序列长度如下：GSK-3β的上游引物序列为5′-TCGTCCATCGATGTGTGGTC-3′，下游引物序列为5′-TTGTCCAGGGGTGAGCTTTG-3′，合成长度为202bp，退火温度为60℃;Akt的上游引物序列为5′- AGAGAGCCGAGTCCTACAGAATA-3′，下游引物序列为5′-CCGAGAGAGGTGGAAAAACA-3′，合成长度为133bp，退火温度为61℃;GAPDH的上游引物序列为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，合成长度为500bp，退火温度为60℃。

2.4.1.3 凝胶成像 制备1.5%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中。取5 μL样本和1 μL上样缓冲液，混合成6 μL上样液。琼脂糖凝胶上样后接通电源，110V，约1 h。放入凝胶成像系统拍照并分析条带。

2.4.2 Western-blot法测定大鼠肝组织中GSK-3β、AKT的蛋白表达情况

2.4.2.1 蛋白样品制备 取100 mg肝组织，于冰上在EP管内剪碎，加入裂解液，用超声破碎仪充分匀浆裂解。将匀浆裂解液在离心机中4℃、14 000 rpm离心10 min;将上清液转移至新的冰上预冷的1.5 mL EP管中，得到全蛋白提取物，可以进行蛋白定量。

2.4.2.2 BCA法测定蛋白含量 按说明书将蛋白样本稀释。试剂A：试剂B（50∶ 1）配制，计算样本浓度。使每孔上样蛋白量达40 μg，混匀后置沸水浴5 min。10 000 rpm转1 min后直接取上清液上蛋白样本。

2.4.2.3 电泳 配10%分离胶。配5%浓缩胶，胶液加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，然后将梳子水平插入，4℃静置2h。将其放入电泳槽中，分别加入样本和ladder。电泳时样本在浓缩胶时恒压80V，在分离胶时恒压120V。取胶，将胶放置在含有转膜液的托盘内。

2.4.2.4 转膜 在冰盆中湿转，1L湿转液。将夹子放入转膜槽中。恒压100V，78 min定时。

2.4.2.5 封闭 根据目的蛋白分子量将膜剪成细条放入封闭盒内，加5%的封闭液，放入水浴箱内，37℃，缓慢振荡1.5h。倒掉封闭液，TBST于摇床上洗3次，每次3 min。

2.4.2.6 抗体孵育与免疫反应 一抗滴加于膜上，室温下轻摇孵育1h后4℃静置过夜;膜用TBST洗3次，每次10 min于摇床上;加入稀释二抗后放于37℃水浴中1 h;TBST洗3次，每次10 min。

2.4.2.7 化学发光 将发光液试剂盒按比例于EP管中混匀，滴加于膜上，放入发光仪进行曝光并拍照。

2.5 统计学方法 应用 SPSS 16.0 软件，所得数据以均数加减标准差（x±s）表示，组间差异显著性检验用t检验，单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 饲养8周后各组大鼠体重的变化 各高脂饲料组与对照组相比较，大鼠体重明显增加（P<0.05），成功筛选出食源性肥胖大鼠。见表1。

3.2 饲养12周后各组大鼠胰岛素敏感指数的变化 各高脂饲料组与对照组相比较，大鼠胰岛素敏感指数明显下降（P<0.05）。见表2。

3.3 饲养12周后各组大鼠血液中胰岛素水平的变化 各组间经两两比较，血液中胰岛素水平差异无统计学意义（P<0.05）。见表3。

3.4 给予药物干预后各组大鼠血糖水平的变化 模型组与对照组相比较，大鼠血糖水平明显提高（P<0.05）;苦荞麦总黄酮低、中、高剂量组、西药组与模型组相比较，大鼠血糖水平明显下降（P<0.05），其中苦荞麦中剂量组与西药组降血糖效果较好。见表4。

3.5 给予药物干预后各组大鼠血液中胰岛素水平的变化 模型组与对照组相比较，大鼠胰岛素水平明显下降（P<0.05）;苦荞麦总黄酮低、中剂量组、西药组与模型组相比较，大鼠胰岛素水平明显提高（P<0.05），其中苦荞麦中剂量组、西药组与对照组胰岛素水平相近。见表5。

3.6 给予药物干预后各组大鼠胰岛素敏感指数的变化 模型组与对照组相比较，大鼠胰岛素敏感指数明显下降（P<0.05）;苦蕎麦总黄酮中、高剂量组、西药组与模型组相比较，大鼠胰岛素敏感指数明显提高（P<0.05），其中苦荞麦中剂量组与西药组大鼠胰岛素敏感指数与对照组相近。见表6。

3.7 各组大鼠肝组织中GSK-3β mRNA的相对表达情况 与对照组相比较，模型组组织中GSK-3β mRNA的表达明显提高（P<0.05）;苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组和模型组相比较，GSK-3βmRNA的表达明显下降（P<0.05）。如图1所示，见表7。

3.8 各组大鼠肝组织中Akt mRNA的相对表达情况 与对照组相比较，模型组组织中Akt mRNA 的表达明显减少（P<0.05）;苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组和模型组相比较，Akt mRNA 的表达明显增加（P<0.05）。如图2所示，见表8。

3.9 各组大鼠肝组织中GSK-3β蛋白的相对表达情况 模型组与对照组相比较，组织中GSK-3β蛋白的表达明显增加（P<0.05）;苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组与模型组相比较，GSK-3β蛋白的表达明显减少（P<0.05）。如图3所示，见表9。

3.10 各组大鼠肝组织中AKT蛋白的相对表达情况 模型组与对照组相比较，组织中AKT蛋白的表达减少有统计学差异（P<0.05）;苦荞麦总黄酮中剂量组、西药组与模型组相比较，AKT蛋白的表达增加有统计学差异（P<0.05）。如图4所示，见表10。

4 讨论

本实验结果表明，苦荞麦总黄酮低、中、高3个剂量组中，中剂量组效果最好。和模型组相比较，苦荞麦总黄酮中剂量组与西药组在控制T2DM大鼠血糖方面效果显著，可明显提高T2DM大鼠胰岛素水平，提高其胰岛素敏感指数。证明苦荞麦总黄酮对T2DM大鼠的病情有积极影响，其机制与苦荞麦总黄酮能使胰岛素转导通路中GSK-3βmRNA和蛋白表达减少、Akt mRNA和蛋白表达增加有关。

研究表明，多数T2DM患者存在IR[15]，降低IR是治疗T2DM的关键[16]，IR与胰岛素作用调节通路有关[17]。胰岛素信号转导通路中激活的Akt使 GSK-3β磷酸化而失活[18]，阻止GSK-3β对其底物糖原合成酶的磷酸化作用，糖原合成酶去磷酸化后恢复活性，发挥糖原合成作用，减少细胞中葡萄糖浓度。并且GSK-3β影响糖原合成酶活性不受胰岛素浓度影响[19]。同时有实验表明使用高选择性抑制剂抑制GSK-3β 活性可增加葡萄糖的转运从而提高胰岛素的活性[20]，减少IR，进而达到降血糖作用。

因此，可以肯定激活Akt基因与蛋白表达、抑制GSK-3β基因与蛋白表达对降低T2DM大鼠血糖水平，升高胰岛素敏感指数及改善胰岛素抵抗有一定效果。苦荞麦总黄酮通过影响胰岛素信号转导通路中GSK-3β与Akt两个基因与蛋白的表达影响T2DM大鼠。

本实验通过选择使用链脲佐菌素（STZ）选择性破坏动物胰岛β细胞从而导致糖尿病[21-22]，目前国内广泛采用高脂高糖饮食联合注射小剂量STZ建立T2DM模型，该模型具有高血糖、胰岛素抵抗等特点，与人类糖尿病发病过程和发病机理相似[23]。苦荞麦作为一种药食同源的植物，在改善T2DM的血糖水平，胰岛素抵抗方面，有一定的开发潜力。

参考文献

[1]International Diabetes Federation. Diabetes Atlas Eighth Edition[Internet]. http：//www.diabetesatlas.org， 2017.

[2]葛均波，徐永健，王辰.内科学[M].9 版.北京：人民卫生出版社，2018：128.

[3]Nadarajan Sarega，Mustapha Umar Imam，Norhaizan Md Esa，et al. Effects of phenolic-rich extracts of Clinacanthus nutans on high fat and high cholesterol diet-induced insulin resistance[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine，2016，16（1）：88.

[4]GAO Chong，Hlscher Christian，LIU Yueze，et al. GSK3： a key target for the development of novel treatments for type 2 diabetes mellitus and Alzheimer disease[J]. Reviews in the neurosciences，2012，23（1）：1-11.

[5]Lappas M.GSK3β Is Increased in adipose tissue and skeletal muscle from women with gestational diabetes where it regulates the inflammatory response [J].Plos One，2014，9（12）：e115854.

[6]ZHANG T，FANG M，FU Z M，et al.Expression of PI3-K，PKB and GSK-3 β in the skeletal muscle tissue of gestational diabetes mellitus [J]. Asian Pac J Trop Med，2014，7（4）：309-312.

[7]Motawi T M，Bustanji Y，Elmaraghy S A，et al.Naproxen and cromolyn as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors for amelioration of diabetes and obesity： an investigation by docking simulation and subsequent in vitro/in vivo biochemical evaluation[J]. J Biochem Mol Toxicol，2013，27（9）：425-436.

[8]WU J， CHEN M， SHI S， et al. Hypoglycemic effect and mechanism of a pectic polysaccharide with hexenuronic acid from the fruits of， Ficus pumila， L. in C57BL/KsJ db/db mice[J]. Carbohydrate Polymers， 2017 （178）：209-220.

[9]王薪寧，徐斌，周金培，等.基于新靶点的抗糖尿病药物研究进展[J].中国药科大学学报，2015，46（2）： 141-152.

[10]Walter R. Jaffé. Health Effects of Non-Centrifugal Sugar （NCS）： A Review[J]. Sugar Tech， 2012， 14（2）：87-94.

[11]扶庆权.正交试验法优化苦荞总黄酮的提取工艺[J].湖北农业科学，2013，52（9）：2138-2140.

[12]黄萍，何兵，刘艳，等.不同来源的苦荞茶中4种黄酮的含量测定[J].食品研究与开发，2017，38（1）：135-138.

[13]高雪，安至超，何其英，等.高脂饲料喂养时间对2型糖尿病肾病大鼠模型的影响[J].中国实验动物学报，2018，26（1）∶114-119.

[14]吴瑛，张勇，姚合斌.高脂联合小剂量链脲佐菌素建立实验性2型糖尿病大鼠模型[J].转化医学杂志，2017，6（6）∶355-57.

[15]吴国柱，杨士杰，蒋玉清，等.胰岛素样生长因子-1在代谢综合征大鼠和糖尿病大鼠膀胱中的表达变化[J].中华实验外科杂志，2015，32（9） ： 2199-2202.

[16]张洪梅.观察葛根素对2型糖尿病患者胰岛素抵抗的影响[J].世界最新医学信息文摘，2018，18（21）：111.

[17]袁荣华，黄起壬，柯临慧.胰岛素抵抗机制的研究现状和进展[J].九江学院学报（自然科学版），2010，25（4）：109-111.

[18]王梦华，卢均坤.PI3K/Akt信号通路及其抑制剂的研究进展[J].医学信息，2018，31（10）：34-36.

[19]T.P. Ciaraldi，L. Carter，S. Mudaliar，R.R. Henry. GSK-3β and control of glucose metabolism and insulin action in human skeletal muscle[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2009，315（1）：153-158.

[20]Erik J Henriksen. Dysregulation of Glycogen Synthase Kinase-3 in Skeletal Muscle and the Etiology of Insulin Resistance and Type 2 Diabetes[J]. Current Diabetes Reviews，2010，6（5）： 285-293.

[21]招少枫，江钟立，王磊.饮食和运动干预对2型糖尿病大鼠心肌Bcl-2和Bax表达的影响[J].中国康复医学杂志，2006（5）：393-397.

[22]WU Kenneth K，HUAN Youming. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats[J]. Current Protocols in Pharmacology，2008，Chapter 5.

[23]上官若男，朱斌，尚画雨，等.改善Ⅱ型糖尿病大鼠糖代谢运动模型的建立[J].中国实验动物学报，2017，25（3）：275-280.

（收稿日期：2019-07-05 编辑：陶希睿）