不同菌种固态发酵对普洱茶化学成分和感官品质的影响

单治国，张春花*，周红杰，强继业

（1.普洱学院，云南普洱 665000；2.云南农业大学，云南昆明 650201）

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种［Camelliasinensis（Linn.）var.assamica（Masters）Kitamura］的晒青毛茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺（微生物固态发酵）制成。其熟茶独特品质特征为：外形色泽红褐，内质汤色红浓明亮，香气独特陈香，滋味醇厚回甘，叶底红褐［1］。因独特的陈香和保健功效，近年来备受国内外消费者关注。

有益微生物的发酵作用在普洱茶品质形成中起决定性的作用［2，3］，是普洱茶品质形成的必要条件，离开了有益微生物和湿热作用，云南大叶种晒青毛茶难以形成普洱茶特有品质风格［4］。目前关于有益菌固态发酵对普洱熟茶化学成分和感官品质方面的影响研究在国内外鲜有报道。周红杰［5］研究表明，在渥堆过程的不同时期，黑曲霉、青霉属、根霉属、酵母属、米曲霉等微生物大量生长并占据微生物种群的主要地位。陈宗道研究发现［6］，普洱茶渥堆过程中存在有黑曲霉（Aspergillus niger）、灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）、青霉（Penicillium sp）、根霉（Rhizopussp）和酵母（Saccharomyces sp.）等微生物，并认为黑曲霉约占微生物总数的80%左右。罗龙新、马静等研究认为［7］，在普洱茶加工过程中存在有霉菌和酵母菌。韩俊等［8］在针对普洱茶加工过程中微生物及酶系变化的研究中，发现黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶的整个加工过程中。陈宗道与刘勤晋［9］等的研究均提出微生物分泌的胞内酶（多酚氧化酶、抗坏血酸酶、过氧化物酶等）及呼吸代谢产生的热量对普洱茶品质形成起着非常重要的作用。渥堆过程中茶叶的内含物成分发生一系列的反应，并生成更为复杂但对普洱茶品质有利的产物［10］。多酚氧化酶与黑曲霉的增长呈高度正相关，与微生物群落的总量消长也呈同一趋势［11］。同时，在微生物胞外酶酶促作用和湿热作用以及微生物内代谢作用下，以茶多酚［12］、氨基酸、糖类、嘌呤碱等为主体的滋味物质发生了氧化、聚合、降解、分解、转化，使得儿茶素（尤其是酯型儿茶素）和氨基酸总量减少及内部配比的改变（尤其是人体必需的8种氨基酸的增加），主要表现为可溶性糖的减少、单糖、双糖配比的改变以及嘌呤碱内部的相互转化，从而使这些鲜、甜、酸、涩、苦、醇味物质，通过消杀、变调、相柔、阻碍等作用，最终综合协调形成了醇和的品质特点。王增盛［13］研究表明强烈的水热作用及微生物分泌的各种胞外酶的作用，茶叶中固有的挥发性香气成分和各种香气物质（如糖类、氨基酸、脂肪、类胡萝卜素、萜烯甙、儿茶素及其氧化产物等）发生转化、异构、降解、聚合、偶联等反应，形成了以萜烯醇类和酚类为主体的香气组分配比。普洱茶香气成分的重要特色在于渥堆过程中形成了大量芳香族化合物［14］，如1，2，3-三甲氧基苯、1，2-二甲氧基苯等；而固态发酵茶中的许多有典型霉味和陈香的物质，可能是相应化合物通过霉菌的作用而发生甲基化反应形成的［15］。

普洱茶渥堆过程中微生物菌种的变化是极其复杂的，有的微生物自始至终对普洱茶品质的形成发挥着重要积极的作用，有的微生物却是在普洱茶加工的某一阶段发挥着形成普洱茶独特风格的作用，有的微生物的产生则不利于普洱茶品质的形成。本研究探讨了授权专利菌种（绿色木霉Trichoderma viride Pers.ex Fr.、黑曲霉Aspergillus niger van Tieghem、少根根霉Rhizopus arrhizus Fischer、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）固态发酵对普洱熟茶化学成分和感官品质的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌种及来源

少根根霉、黑曲霉、酿酒酵母、绿色木霉，均由云南农业大学普洱茶研究院分离、纯化、鉴定、保存、筛选、扩繁而得，并获授权专利。

1.2 实验材料

材料：云南农业大学普洱茶研究院采用临沧地区云南大叶种茶树（Camellia Sinensis（Linn.）Var.assamica（masters）Kitamura）鲜叶制成的晒青毛茶以及使用该毛茶分别接种四种有益菌种固态发酵而制成的普洱茶。

1.3 试验方法

用小型喷雾器将四种有益菌种（少根根霉、黑曲霉、酿酒酵母、绿色木霉），按液茶比为1︰10的比例均匀洒在晒青毛茶上进行普洱茶固态发酵，重复3次，控制发酵茶堆温度在40-60℃，湿度在35%，发酵环境温度在25℃，环境湿度在80%，翻堆6次，共计发酵55天。

1.4 分析方法

水浸出物含量测定:GB/T 8305-2002;茶多酚(TPs)总量测定:GB/T 8313-2002;游离氨基酸总量测定:GB/T 8314-2002;咖啡碱的测定：GB/T 8312-2002;可溶性总糖的测定:蒽酮比色法;黄酮类化合物总量的测定——三氯化铝比色法[16]；茶红素(TR)、茶褐素(TB)：比色系统分析法[16]。

1.5 数据处理及分析

SPSS数据处理系统软件;差异显著性通过Duncan新复极差测验(SSR法)进行统计分析,结果采用字母表示法[17]。

1.6 感官审评方法

实验样3.0g，用150mL沸水冲泡，静置5min，重复3次［18，19］，密码审评各茶样的香气、滋味与汤色，用评分与评语相结合的方法反映其品质。评分采用百分制，每5分为一档，2～3分为半档。

2 结果与分析

2.1 主要化学成分的变化

对茶样的水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡碱、黄酮、茶黄素、茶红素、茶褐素含量的测定结果分析如表1。

表1 不同有益菌固态发酵对普洱茶化学成分的影响Tab.1 Effects of Different Beneficial Microorganisms Solid State Fermentation on Chemical Compositions of Pu-erh Tea 单位：%（以干基计）unit%

2.1.1 水浸出物含量的变化

普洱茶中的水浸出物是茶汤的主要呈味物质，水浸出物含量的高低反映了普洱茶中可溶出物的多少，标志着茶汤的厚薄、滋味的浓强程度，从而在一定程度上反映普洱茶品质的优劣。水浸出物含量高则味浓，反之则淡。水浸出物含量大于40%，说明普洱茶内含物相当丰富，也为普洱茶滋味的浓醇和耐冲泡奠定了物质基础。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，水浸出物的含量呈下降趋势，下降幅度从大到小依次是：少根根霉＞酿酒酵母＞黑曲霉＞绿色木霉，且成品普洱茶中水浸出物含量差异达到极显著（P＜0.01），接种绿色木霉发酵的普洱茶水浸出物含量明显的高于其他三种有益菌发酵的普洱茶，且达到40.82%，滋味浓醇。

2.1.2 茶多酚含量的变化

茶多酚是形成普洱茶品质的重要活性物质,在茶汤中呈苦涩,有较强的刺激性，对茶叶的色、香、味都有很大的影响，在加工过程中发生一系列水解、异构、氧化、聚合等反应，使茶汤滋味变得浓强或醇和。普洱茶的多酚类物质大致可分为未被氧化的多酚类物质（主要是残留儿茶素）、水溶性的氧化产物（主要是TF、TR、TB）和非水溶性的氧化产物（主要是与蛋白质结合的不溶性大分子物质）三大部分。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，茶多酚含量呈下降趋势，下降幅度从大到小依次是：少根根霉＞绿色木霉＞黑曲霉＞酿酒酵母。接种酿酒酵母发酵的普洱茶中茶多酚含量高于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01）；接种绿色木霉、黑曲霉发酵的普洱茶中茶多酚含量差异不显著，滋味醇厚甘滑；接种少根根霉发酵的普洱茶中茶多酚含量低于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01），滋味甘醇。

表2 不同有益菌固态发酵对普洱茶感官品质的影响Tab.2 Effects of Different Beneficial Microorganisms Solid State Fermentation on Organoleptic Quality of Pu-erh Tea

2.1.3 氨基酸总量的变化

茶叶氨基酸的组成、含量以及降解产物和转化产物直接影响茶叶品质，主要是影响茶叶的香气和滋味，它与多酚类混合在一起，能增进茶叶的鲜爽味。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，氨基酸含量呈下降趋势，下降幅度从大到小依次是：绿色木霉＞黑曲霉＞酿酒酵母＞少根根霉。接种少根根霉发酵的普洱茶中氨基酸含量低于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01）；接种绿色木霉、酿酒酵母发酵的普洱茶中氨基酸含量差异不显著，且含量超过2.00%，滋味在鲜爽度和回甘度方面好于其他二种有益菌发酵的普洱茶。

2.1.4 咖啡碱含量的变化

咖啡碱是普洱茶生物活性物质之一，也是构成普洱茶茶汤滋味的重要呈味物质，对普洱茶的品质有重要作用，适量的咖啡碱使滋味鲜爽，而过量则使茶汤带苦味。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，咖啡碱的含量呈增加趋势，增加幅度从大到小依次是：少根根霉＞黑曲霉＞绿色木霉＞酿酒酵母。普洱茶中咖啡碱含量差异达到极显著（P＜0.01），接种绿色木霉发酵的普洱茶咖啡碱含量明显的高于其他三种有益菌发酵的普洱茶。

2.1.5 黄酮含量的变化

茶叶中的黄酮类化合物主要是黄酮醇及其苷类，是构成茶黄素的重要组分[20，21]，能溶于热水，对茶的色泽和滋味都有一定的影响。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，黄酮的含量呈增加趋势，增加幅度从大到小依次是：少根根霉＞黑曲霉＞绿色木霉＞酿酒酵母。接种少根根霉发酵的普洱茶中黄酮含量高于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01）；接种绿色木霉、酿酒酵母发酵的普洱茶中黄酮含量差异不显著，与其他两种有益菌发酵的普洱茶中黄酮含量差异达极显著（P＜0.01）。

2.1.6 水溶性灰分的变化

灰分中能溶于沸水的部分称之为水溶性灰分，水溶性灰分与茶叶品质呈正相关，水溶性灰分含量高，或占总灰分的比率大是茶叶品质好的象征。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，从原料至固态发酵结束，水溶性灰分的含量呈增加趋势，增加幅度从大到小依次是：黑曲霉＞绿色木霉＞少根根霉＞酿酒酵母。接种黑曲霉发酵的普洱茶中水溶性灰分含量高于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01）；接种绿色木霉、少根根霉发酵的普洱茶中水溶性灰分含量差异不显著，与其他两种有益菌发酵的普洱茶中水溶性灰分含量差异达极显著（P＜0.01）。

2.1.7 可溶性糖的变化

可溶性糖具有甜味，是构成茶汤滋味和香气的因素之一，它们是茶汤甜味的主要组成部分，它不仅使茶叶滋味甜醇，而且对咖啡碱的苦涩味具有一定的抑制和协调作用，可溶性糖含量越高，茶叶滋味越甘醇而不苦涩。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，从原料至固态发酵结束，可溶性糖分的含量呈增加趋势，增加幅度从大到小依次是：少根根霉＞黑曲霉＞绿色木霉＞酿酒酵母。接种少根根霉发酵的普洱茶中可溶性糖含量高于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01），滋味甘醇；接种绿色木霉、黑曲霉发酵的普洱茶中可溶性糖含量差异不显著，与其他两种有益菌发酵的普洱茶中可溶性糖含量差异达极显著（P＜0.01）。

2.1.8 茶色素含量变化

普洱茶主要色素物质是茶黄素、茶红素、茶褐素，目前认为这三种色素是茶多酚的主要水溶性氧化产物，茶黄素是茶汤“亮”的主要成分；茶红素是茶汤“红”的主要成分；茶褐素是茶汤“褐”的主要成分［22］。从表1，表2可知：与晒青毛茶原料（CK）样相比，在四种有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）的作用下，从原料至固态发酵结束，茶红素的含量呈下降趋势，下降幅度从大到小依次是：酿酒酵母＞绿色木霉＞黑曲霉＞少根根霉；茶褐素含量呈增加趋势，增加幅度从大到小依次是：黑曲霉＞绿色木霉＞少根根霉＞酿酒酵母。接种绿色木霉、酿酒酵母发酵的普洱茶中茶红素含量差异不显著，与其他两种有益菌发酵的普洱茶中茶红素含量差异达极显著（P＜0.01）；接种黑曲霉发酵的普洱茶中茶褐素含量高于其它三种有益菌发酵的普洱茶，差异达极显著（P＜0.01）；其他三种有益菌发酵的普洱茶中茶褐素含量差异不显著。

2.2 感官评审结果

从表2可知：用有益菌（绿色木霉、黑曲霉、少根根霉、酿酒酵母）固态发酵的普洱茶从原料到出堆样外形差异不明显，内质上有一定的差异，主要表现在滋味和香气方面。用绿色木霉发酵的普洱茶滋味浓醇回甘，香气陈香透花-木香；黑曲霉发酵的普洱茶滋味醇厚，陈香透花果香；少根根霉发酵的普洱茶滋味醇厚甘滑，陈香浓；酿酒酵母发酵的普洱茶滋味醇和甘滑，香气陈香较显，这与理化成分含量分析相吻合。

经方差分析表明：接种绿色木霉、黑曲霉发酵的普洱茶品质之间差异不显著，与酿酒酵母发酵的普洱茶品质间差异达极显著（P＜0.01）；接种少根根霉发酵的普洱茶品质与其它三种有益菌发酵的普洱茶差异达极显著（P＜0.01）。

3 结论与讨论

3.1 绿色木霉发酵的普洱茶滋味浓醇回甘，香气陈香透花木香，与其他三种微生物固态发酵相比水浸出物、氨基酸、咖啡碱的含量最高，分别是40.82%，2.33%，4.60%。绿色木霉能分泌酶类作用于基质，可抑制其他杂菌的生成，并能与其他菌种配合发挥良好的作用，促进普洱茶“浓醇”品质的形成。

3.2 黑曲霉发酵的普洱茶滋味醇厚，陈香透花果香，与其他三种微生物固态发酵相比茶褐素含量最高，12.24%。普洱茶品质与绿色木霉发酵的差异不显著。黑曲霉在发酵过程中可分泌胞内和胞外两类酶系。普洱熟茶固态发酵过程中，黑曲霉产生的胞外酶可把发酵茶叶中不溶解的有机物水解为可溶的，把生物大分子有机物催化水解成便于微生物吸收和利用的小分子有机物。被分解的有机物质包括多糖、脂肪、蛋白质、天然纤维素、半纤维素、果胶和不可溶性碳水化合物等，水解产物大多为单糖、寡糖、氨基酸、水化果胶和可溶性碳水化合物等。从而使茶叶内含物质的有效成分易于渗出，为增强普洱茶茶汤滋味提供了前提条件，是形成普洱茶甘滑、醇厚的物质基础［23］。

3.3 少根根霉发酵的普洱茶滋味醇厚甘滑，陈香浓，与其他三种微生物固态发酵相比可溶性糖含量最高，6.07%。根霉在固态发酵中能产生糖化酶、果胶酶、蛋白酶等。这些酶及其代谢产物的出现有利于普洱茶粘滑和醇厚品质的形成。

3.4 酿酒酵母发酵的普洱茶滋味醇和甘滑，香气陈香较显，与其他三种微生物固态发酵相比茶多酚、氨基酸、茶红素含量最高，分别是11.41%，2.37%，2.43%。酵母菌分泌酶类可发挥生物催化作用，将在制茶中不溶或难溶的大分子化合物转化为易溶于水的小分子化合物。据周红杰等［24］研究认为在水分适度时，大量酿酒酵母的生长对普洱茶甜醇滋味的形成有重要作用。

茶叶中水浸出物是指能被水浸泡出的物质，是茶汤的主要呈味物质，标志着茶汤的厚薄、滋味的浓强程度。发酵过程中水浸出物的含量是减少的，这可能是因为微生物的大量生长消耗了一些可溶性物质，同时不溶性的物质（不溶性茶多酚）则有所增加。

咖啡碱是茶叶中主要的嘌呤碱，是构成茶汤的重要滋味物质，与普洱茶品质呈正相关。咖啡碱的含量在普洱茶发酵过程中呈增加趋势。咖啡碱含量的增加主要是微生物的作用。已有研究表明，在茶叶发酵过程中，霉菌可以增加咖啡碱的含量，而酵母则降低其含量。而且在霉菌中，黑曲霉的作用最大，其可以显著增加咖啡碱的含量［25］。

氨基酸是构成茶汤滋味的重要化学成分，能增强茶叶的鲜爽味。氨基酸在普洱茶发酵的特殊温湿条件下发生氧化、降解和转化，与多酚类起反应生成褐色色素，还可以与碳水化合物发生梅拉德反应，聚合形成大分子的不溶性黑色素。因此，在普洱茶渥堆发酵过程中氨基酸总体呈减少趋势。

普洱茶中的多糖类主要有2个来源：一是茶叶本身所固有的和在“固态发酵”过程中微生物所转化的，二是由微生物代谢所生成的，如酵母菌的细胞壁含有甘露聚糖、葡聚糖成分等［2］。在发酵初期，可溶性糖有所增加；然而，由于微生物的大量繁殖，作为微生物碳源的可溶性糖的消耗也随之增加，而可被分解的碳水化合物则逐渐减少。同时，由于可溶性糖还可与氨基酸产生梅拉德反应，因此，在渥堆的后期可溶性糖含量便逐渐减少。

微生物固态发酵是普洱茶加工的关键工序，对普洱茶品质的形成具有重要意义。它是以晒青毛茶的内含成分为基质，在微生物分泌的胞外酶（多酚氧化酶、抗坏血酸酶等）的酶促作用、微生物呼吸代谢产生的热量和茶叶水分的湿热作用的协同下，发生以茶多酚转化为主体的一系列复杂而剧烈的化学变化，从而实现普洱茶特有的色、香、味［22］。微生物生命活动和代谢是普洱茶品质风味形成的重要影响因子。目前国内外学者对普洱茶渥堆的研究还只是停留在菌种筛选，温度、水分等环境条件［26］以及发酵时间［27］对普洱茶发酵的影响这几个方面。但不同微生物到底对普洱茶发酵造成什么样的影响，对促进普洱茶特征成分的变化有什么样的作用，目前还没有研究清楚。普洱熟茶微生物固态发酵的一系列反应中，微生物的参与起到了极为关键的重要作用，有益微生物参与发酵的作用机理仍需要进一步的深入研究。