粪大肠菌群酶底物法在环境监测中的应用研究

文_黄瑾璟 绍兴市环境监测中心站

粪大肠菌群通常可在44～45℃下生长，其也被称为耐热大肠菌群，该菌群普遍来源于人畜的粪便，能够传播肠道传染病，同时其也是水质污染监测中的一项十分重要的指标。酶底物法是一种全新的大肠杆菌群监测方法，这种方法具有诸多优势，可充分反映及监测水中的粪便污染情况，从而控制流行病的传播。

1 研究背景

水体微生物污染情况非常严重，而粪便污染则是造成微生物污染的主要来源，粪便当中有诸多的病原微生物、病毒和原生动物蠕虫，上述污染源能够引起肠道传染疾病的广泛传播。人们普遍应用粪大肠杆菌群来评价水体的污染状况，从而了解水质对人体健康的影响程度。这其中粪大肠菌群具有较强的代表性，故而其在国内的诸多标准当中都得到了非常广泛的应用。从检测角度来看，使用粪大肠杆菌群酶底物法进行水质监测，对科研探究有着及其重要的作用，其具有快速和方便等诸多优势。

2 酶底物法概述

酶底物法主要利用大肠菌群生长中所产生的β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶，分解培养液中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷和β-葡萄糖醛酸，从而使培养液出现色变，呈现黄色，并发生荧光反应来完成检测工作，最后以阳性组合为基础，查阅MPN表得出最终的数量。在操作中，首先应结合水样的污染程度稀释待测水样，之后再取100ml的混浊水样，将其放置在无菌瓶当中，加入1份柯丽德试剂，将其溶解并混合均匀，然后将其倒入97孔定量盘，同时还要进行封口处理。在44.3～44.7℃的培养箱当中培养，时间为24h，结合其阳性孔数查阅MPN表，对其进行精确计算。

酶底物法最初在美国出现，之后逐渐被推广使用，如今采用这种检测方法检测粪大肠菌群、总大肠杆菌群以及大肠艾希氏菌也获得了有关部门和机构的认证，在美国、欧洲及日本等多个地区都得到了十分广泛的应用。而在我国提出的生活饮水卫生标准当中，也将这种方法作为检测总大肠杆菌群的标准方法，但是酶底物法还没有成为粪大肠菌群监测的标准方法。

3 酶底物法与其它方法的比较分析

国内的粪大肠菌群检测普遍应用国外早期的检验方法，主要采用MPN法和滤膜法。而微生物监测技术在不断发展和完善，在监测的过程中也出现了纸片法、固定酶底物法以及生物学鉴定法，这些方法也得到了相对较为广泛的应用。以下将对酶底物法与其他的检测方法在操作难度、场所人员要求、是否需要确认实验、检测时间、检测的准确性、检测费用和推广难度方面进行简要的对比分析。

发酵法和滤膜法操作较为繁琐，对场所和人员的专业性要求较高，同时需要确认试验，检测的时间较长，通常需要48～72h，且检验的结果比较准确，检验的费用不高，因此也更容易推广。

酶底物法和纸片法操作较为简单，且对场所和人员无十分严格的要求，且检测的结果比较准确，酶底物法不需要确认实验，其检测的时间一般为24h，检测的费用较高，但因为其检测效果好，推广相对容易。不仅如此，纸片法需要确认实验，其检测的时间一般在16～18h之间，检测费用较低，故而推广较为方便。

聚合酶链式技术和荧光原位杂交技术操作相对繁琐，对场所和人员的专业性有着极高的要求，不需要进行确认实验，检测费用较高，虽然其检测结果十分准确，但是由于其在费用、操作和场所人员等方面的要求比较高，所以推广难度相对较大。

酶底物法取样加药后就可以封口培养，操作流程相对简单，且不会出现严重的污染现象，虽然纸片法在操作上也比较便捷，但是在操作过程中受外界因素影响较大，需要确认实验，而酶底物法的查表结果更加精确，其在粪大肠菌群检测过程中假阳性和阴性现象不多，因此酶底物法的准确性更高，综合性更强。

4 酶底物法的研究现状

酶底物法在美国首次出现并应用，这种方法测定粪大肠菌群已经获得EPA的认证，在多个地区都得到了非常好的应用。虽然这种方法并没有成为我国粪大肠菌群的标准检测方法，但是学者也对其进行了大量的研究。部分研究人员对固定底物酶底法和多管发酵法检测粪大肠菌群进行了比较，两种方法检测的结果一致。

此外，一些研究人员在多组数据对比后，证明DST-酶底物法与多管发酵法在检测粪大肠菌群的结果相同。研究人员认为固定底物酶底物法与多管发酵法在本质上并无差别。一些研究人员采用酶底物法对稀释后的地表水水样进行了培养和检测，检测后发现水样稀释数据越精确，检测结果的准确性也就越高。同时酶底物法还成为了地震灾害中，居民生活饮用水供水安全检测的主要方法，而且在应急监测中也具有十分积极的作用。所以说酶底物法是评价水质微生物污染的一种有效且迅速的检测方法。

5 酶底物法应用前景分析

与其它的粪大肠菌群检测方法相比，酶底物法的操作更加便捷，检测结果的准确性更高，检测速度也更快，相信这种检测方法在日后的环境监测当中会具有十分广阔的应用及发展空间。

首先，在我国环境监测工作中，粪大肠菌群是非常重要的卫生学指标，而且采用酶底物法检测粪大肠菌群能够充分顺应检测技术发展的要求。

其次，当前我国主要应用传统的粪大肠菌群检测方法，操作的过程相对较为复杂，同时检测中所需要的时间也比较长，很多方法需要48～72h才能获得最终的检测结果，另外其对检测条件及检测者的技术能力也提出了十分严格的要求。在保存水样的过程中，对水样保存的条件有着非常细致且严格的要求，故而在我国中西部地区，传统的检测方法并不能得到广泛的应用，而这也影响了我国中西部地区卫生检测工作的质量和水平。

再次，在粪大肠菌群检测的过程中，采用酶底物法具有非常明显的优势，这种方法检测速度快，且检测结果的准确性较高。在检测中不需要清洗玻璃器皿，对检测环境没有十分严格的要求。检测可在非无菌环境下进行，与此同时，检测中也不需要专门配置培养基。在24h之内就可以对其进行定量检测，故而这种方法的应用也大大减少了粪大肠菌群检测的工作压力。另外，采用这种检测方法还可规避多管发酵法中逐级稀释所产生的操作误差，很好地防止了检测过程中由于人为因素所造成的肉眼可见的误差，这使得人们可以更加清晰且准确地了解到水质污染的具体情况。

现阶段，国内所采用的粪大肠菌群检测标准没有对酶底物法的使用做出非常细致的规定，但是在西方很多发达国家当中，酶底物法已经广泛地应用于粪大肠菌群的检测工作当中，且这种检测方法也获得了良好的应用效果。国际上的多家机构已经充分认可了酶底物法在粪大肠菌群检测中的作用和价值。因此，在国内粪大肠菌群检测的过程中，也应正确认识到时代发展的基本趋势，将酶底物法应用到粪大肠菌群检测工作中，使其充分发挥自身的作用，进而有效保证我国粪大肠菌群检测的科学性与准确性。

6 结语

酶底物法通常借助粪大肠菌群中的特殊性酶与特殊性底物发生反应，观察颜色的变化和荧光反应，从而判断最终的检测结果。酶底物法在应用的过程中优势明显，其操作便捷，结果非常直观可靠，具有较强的准确性和客观性。但是这种检测方法也存在着非常明显的不足。操作中所使用的培养基均为国外生产，需要较高的费用投入。所以我们应加大科研力度，让酶底物法培养基能够在国内大规模生产，进而有效降低检测费用，拓展该检测方式的应用范围，使其在水质微生物污染评价中以及日常应急监测中，全面发挥出其积极作用。