神经病理性疼痛中神经生长因子的作用及其相关镇痛药物研发进展

颜冰，戴文玲，刘吉华

（中国药科大学中药学院 江苏省中药评价与转化重点实验室，江苏 南京 211198）

神经病理性疼痛是躯体感觉神经系统损伤或功能紊乱而导致的疼痛，全球约有6% ～ 8%的人患有神经病理性疼痛。神经病理性疼痛病程短则数月长则数年，常伴随睡眠障碍、焦虑、抑郁，严重影响患者的生存质量。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是神经营养因子家族成员之一，广泛分布于外周及中枢神经系统、骨骼肌以及腺体中，在胚胎发育、免疫调节、造血等方面具有重要作用。近年来，NGF及其受体已成为治疗神经病理性疼痛的新靶点，人源化NGF单克隆抗体已进入临床试验阶段，具有良好的临床应用前景。本文就目前NGF参与调节神经病理性疼痛的具体机制和调节NGF的镇痛药物的研发进展进行综述，以期为疼痛研究和相关药物研发提供参考。

1 神经生长因子参与调节神经病理性疼痛的作用机制

1.1 神经生长因子的异常表达

在胚胎和幼年动物体内，NGF主要由靶组织（包括皮肤、肌肉和血管组织）内神经合成分泌，促进神经纤维生长、分化和损伤修复；正常成年机体内中枢和外周神经纤维的生存不依赖于NGF，神经系统内NGF蛋白水平极低，而损伤、炎症等情况下炎症细胞及神经胶质细胞、施旺细胞（Schwann cell）、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、结缔组织、肌肉细胞等可大量分泌NGF，调节免疫反应，促进损伤修复，维持机体稳态。研究发现，NGF的异常表达与神经病理性疼痛密切相关。在坐骨神经慢性压迫损伤（chronic instruction injury，CCI）[1]、脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）[2]、紫杉醇[3]等诱导的神经病理性疼痛动物模型中NGF蛋白水平异常升高，临床神经病理性疼痛患者[4]NGF表达上调。其中，在CCI诱导的神经病理性疼痛模型中术侧坐骨神经[5]、背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）[6]、脊髓背角[7]NGF蛋白或转录水平均显著增高。足底注射NGF可剂量依赖性诱发大鼠热痛过敏和机械痛超敏，其中热痛过敏可持续24 h，机械痛超敏持续2周，人皮下注射NGF也出现长达7周的痛觉过敏[8]。应用NGF抗体可显著缓解SNL、链脲霉素（streptozotocin，STZ）、CCI、肿瘤压迫分别诱导的神经病理性疼痛[9-10]。以上研究表明：NGF的异常表达是导致神经病理性疼痛的重要原因，抑制NGF可能是治疗神经病理性疼痛的有效策略。

1.2 神经生长因子与炎症

NGF对炎症反应具有双向调节作用，如在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，NGF可通过抑制炎症反应、促进神经修复从而维持大脑功能，但在神经病理性疼痛中NGF主要通过影响炎症介质的释放间接促进痛觉敏化[11]。神经损伤可诱导炎症细胞聚集，其中巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞等炎症细胞可分泌NGF并表达NGF高亲和力受体原肌球蛋白受体激酶A（tyrosine kinase receptor A，TrkA）和低亲和力受体p75，肥大细胞还可通过自分泌NGF形成正反馈循环，进一步促进损伤部位炎症反应[12]。一方面，NGF与肥大细胞表面NGF受体结合可促进肥大细胞脱颗粒，释放肿瘤坏死因子、白细胞介素、组胺、前列腺素等炎症介质敏化伤害性感受神经元，促进痛觉过敏。Sousa-Valente等[13]发现NGF可促进肥大细胞释放前列素D2（prostaglandin D2，PGD2），而PGD2合成酶抑制剂可显著缓解TrkA基因敲入小鼠骨关节炎疼痛，对野生型小鼠骨关节炎疼痛无缓解作用，表明NGF可通过促进肥大细胞释放PGD2，从而激活伤害性神经元，促进痛觉敏化。另一方面，NGF可与外周感觉神经元细胞表面TrkA受体结合促进P物质（substance P，SP）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等神经递质的合成与释放，释放的神经递质与脊髓神经元表面相应受体结合，进一步激活神经元及周围胶质细胞，诱发神经源性炎症[14]。

1.3 神经生长因子与伤害感受器敏化

神经损伤后外周分泌的NGF作用于伤害感受器表面TrkA受体，通过激活胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酶C （phospholipase C，PLC）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等胞内信号通路，致敏酸敏感性离子通道2/3（acid-sensing ion channel，ASIC2/3）、瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）、瞬时感受器电位M8 （transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）等离子通道，降低离子通道开放阈值，并增加离子通道蛋白表达，促使其向细胞膜转移，从而降低神经元动作电位阈值，提高神经元兴奋性[15-16]。例如NGF可上调DRG神经元膜表面TRPV1蛋白表达，使外周和中枢TRPV1活性持续增强并提高辣椒素诱导的内向电流。Eskander等[17]报道称，NGF可上调脊髓和足底皮肤亚麻油酸及花生四烯酸衍生物含量，并发现NGF可通过调节磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）提高氧化脂质水平从而激活TRPV1，进而参与疼痛的产生及维持。

近年发现的一类不属于经典C伤害性感受器的寂静性伤害感受器，正常的生理性刺激不能激活这类感受器，但炎症及多种化学刺激可活化此类伤害性感受器。寂静性伤害感受器主要分布于关节、膀胱、皮肤等组织，占C伤害性感受器的20%左右。低频率放电刺激可激活机械敏感的寂静性伤害感受器，促进神经病理性疼痛的产生和维持[18]。研究报道，NGF可激活寂静性伤害感受器[19]。Prato 等[20]在DRG神经元中鉴定出一种表达尼古丁乙酰胆碱受体亚型3（CHRNA3）的寂静性伤害感受器，并发现NGF可能通过ERK1/2激活机械门控离子通道PIEZO-2，从而使CHRNA3阳性的寂静性伤害感受器发生敏化，导致痛觉过敏。

1.4 神经生长因子与异位放电

神经病理性疼痛中传入神经元的异位放电是导致自发痛的重要原因。DRG神经元表达多种钠、钙离子通道，外周神经损伤后该部位或邻近未受损的DRG神经元表面多种电压依赖性离子通道的密度与功能均发生改变，产生大量异常动作电位，即异位放电[21]。文献报道称，人足背部注射NGF可降低皮肤电阈值和活动依赖性传导速度，促进异位放电的产生和传导并导致痛觉敏化[8]。研究表明：NGF与多种钠离子通道表达相关，异常高表达的NGF可诱发DRG钠离子通道如Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9等表达增加，从而参与调控神经病理性疼痛[22]。Nav1.7基因敲除鼠足底注射NGF后，未出现NGF导致的痛觉过敏[23]。应用NGF抗体可减少结肠感觉神经元中肠梗阻诱导增加的河豚毒素不敏感型（tetrodotoxin-resistant，TTX-R）钠通道的基因表达及活性，缓解内脏痛[24]。

1.5 神经生长因子与交感神经芽生

正常机体内DRG部位的交感神经并不支配感觉神经元，但研究发现在坐骨神经分支选择性损伤（spared nerve injury，SNI）等神经病理性疼痛动物模型中，DRG内交感神经出芽并入侵感觉神经元，形成篮状结构；阻断交感神经功能可减少篮状结构的产生，缓解神经病理性疼痛[25]。NGF与交感神经芽生有密切联系，用NGF基因敲入小鼠制备的CCI模型DRG内交感神经出芽数量高于野生型小鼠，机械痛超敏和热痛过敏更加严重[26]；应用基质金属蛋白酶2/9（matrix metalloproteinase 2/9，MMP-2/9）抑制剂抑制NGF成熟体降解诱导内源性NGF水平升高，可诱发大鼠交感神经出芽，促进机械痛超敏和热痛过敏[27]。以上研究表明：异常高表达的NGF可通过促进交感神经芽生参与神经病理性疼痛的发生及维持。

1.6 神经生长因子与脊髓中枢敏化

NGF与其受体TrkA结合可形成复合体并内化进入胞内，逆向运输至DRG胞体，促进肽能痛觉神经元释放兴奋性神经递质如SP、CGRP和BNDF等进入脊髓背角，与背角神经元突触后膜表面受体结合，增加脊髓神经元兴奋性，放大痛觉信号[28]。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体激活是形成中枢敏化的关键因素，研究显示BDNF可增强突触后膜NMDA电流，应用NMDA受体抑制剂MK-801可阻断NGF诱导的超敏反应[29]。BDNF也可通过钾氯共转运体（K+-Cl- cotransporter 2，KCC2）影响氯离子反转电位，导致氨基丁酸和（或）甘氨酸通道产生兴奋性氯化物，进一步促进中枢敏化[28]。

2 调节神经生长因子的镇痛药物研发

研究表明，抑制NGF及其受体可有效缓解神经病理性疼痛。基于NGF及其受体的镇痛药物主要是通过阻断NGF、拮抗TrkA受体和（或）p75受体、抑制胞内TrkA激酶活性及NGF/TrkA下游通路等策略开发相关药物。

2.1 神经生长因子抗体

人源化单克隆抗体可通过靶向结合抗原蛋白抑制其生物学功能，从而达到治疗疾病的目的。目前已有多种人源化NGF单克隆抗体正在进行临床试验，用于治疗骨关节炎痛及神经病理性疼痛等慢性疼痛。辉瑞公司研发的tanezumab可显著缓解糖尿病性神经病理性疼痛、带状疱疹后遗神经痛（Ⅱ期临床试验）及慢性下腰痛（属于混合痛，包含神经病理性疼痛）（Ⅲ期临床试验）[30-31]。强生公司研发的NGF单克隆抗体fulranumab可缓解糖尿病性神经病理性疼痛及慢性下腰痛（Ⅱ期临床试验）[32-33]，但对带状疱疹后遗神经痛及创伤性神经病变无镇痛作用[34]。NGF具有促进神经分化的作用，研究表明镇痛剂量的NGF抗体未引起认知功能的下降，对神经系统无显著的副作用[35]，但临床试验中发现NGF抗体可导致神经病变和破坏性关节病[36]等副作用，且NGF抗体诱导的关节破坏程度与剂量及使用时间呈正相关。因此，NGF单克隆抗体的临床应用尚有待进一步研究。

2.2 神经生长因子小分子抑制剂

NGF小分子抑制剂，如ALE-0540、PD 90780和Ro 08-2750，可非共价地改变NGF分子拓扑结构和表面静电势，导致NGF/小分子复合物无法结合TrkA受体和p75受体，从而抑制NGF生物学活性[37]。根据NGF与TrkA或p75的结合特点，可针对NGF表面不同结构域设计小分子抑制剂。NGF loop结构高度可变，不同神经营养因子的loop结构具有显著差异，对于可变的loop结构可设计针对NGF的特定拮抗剂，如PQC 083[38]可结合NGF loop-Ⅰ/Ⅳ结构域，其抑制NGF的 IC50为 7 μmol . L-1。Kennedy 等[39]通过分子对接和表面等离子体共振技术发现，BVNP 0197可结合NGF loop-Ⅱ/Ⅳ裂隙结合域，对NGF抑制效率达纳摩尔级别（IC50= 90 nmol . L-1），优于NGF抑制剂ALE-0540、PD 90780及Ro 08-2750，但目前NGF小分子抑制剂均处于临床前研究阶段。

2.3 拟肽

NGF拟肽是5 ～ 10个氨基酸组成的短肽，可与NGF竞争TrkA或p75受体结合位点，激活或抑制NGF下游信号。D3拟肽（一种NGF拟肽）是一种单价TrkA单体配体，无NGF时其可激活TrkA受体，在NGF存在时可增强NGF活性，Brahimi等[40]通过化学短链连接2种单价D3拟肽，得到类似NGF二聚体形状的化合物，称为1ss，后者可阻断NGF结合TrkA，其IC50为5 μmol . L-1。将拟肽（NGF样作用）通过结构修饰转变为拮抗剂以抑制NGF生物学功能是开发NGF拟肽类拮抗剂的重要方法，目前NGF拟肽用于治疗神经病理性疼痛仍处于临床前研究阶段。

2.4 TrkA抗体

TrkA抗体可通过特异性结合TrkA免疫球蛋白样结构抑制TrkA激酶磷酸化，阻断其下游信号通路。有文献报道，TrkA单克隆抗体MNAC13可有效缓解CCI诱导的神经病理性疼痛及骨折导致的疼痛，且未出现非甾体类镇痛药长期使用导致的骨折难以愈合等副作用[41]。2015年Glenmark公司宣布开展TrkA单克隆抗体GBR900（由啮齿动物抗体MNAC13衍生而来）的Ⅰ期临床试验，但未见后续报道。

2.5 TrkA小分子抑制剂

TrkA小分子抑制剂通过竞争性结合酪氨酸激酶高度保守的ATP位点，抑制TrkA磷酸化从而阻断下游信号通路。由于激酶结构域序列具有高度同源性，早期的TrkA抑制剂对Trk激酶选择性较差。随着X射线晶体衍射技术的发展，Trk蛋白质-配体结构得以阐明，因此基于结构的药物设计（structure-based drug design,SBDD）技术可用于进一步开发高效、选择性的小分子抑制剂。阿斯利康公司从4-氨基咪唑嘧啶衍生物中发现多个具有一定选择性的泛Trk抑制剂，此类抑制剂通过结合ATP位点在铰链区形成氢键以抑制TrkA激酶活性。其中AZ-23抑制TrkA的IC50小于3 nmol . L-1，且可剂量依赖性缓解完全弗氏佐剂（complete freund’s adjuvant，CFA）诱导的疼痛，其镇痛作用优于非甾体类镇痛药[42]。默克公司对现有TrkA抑制剂进行结构优化得到多个化合物，发现相比于DFG（Asp-Phe-Gly）-in构象，与DFG-out构象结合的抑制剂解离常数低，对TrkA抑制活性更高，其中对TrkA抑制活性最高的化合物（IC50= 9 nmol . L-1）口服给药可显著缓解SNL诱导的神经病理性疼痛[43]。Skerratt等[44]以抑制TrkA的活性及选择性等为指标，通过X射线晶体衍射、SBDD及二维定量构效关系技术对吡咯并嘧啶类化合物进行优化，并通过P-糖蛋白（具有ATP依赖性药物外排泵功能）结合活性实验，筛选出外周选择性药物以减少对中枢神经系统的副作用（认知障碍、睡眠障碍）。其中PF-06273340不仅对TrkA抑制活性高（IC50=6 nmol . L-1），且其血浆游离药物浓度远大于大脑游离药物浓度。在随机双盲试验中，PF-06273340可缓解紫外线诱导的人痛觉过敏[45]，具有开发成为临床镇痛药的巨大潜力。TrkA近膜区（juxtamembrane，JM）结构域是调节酪氨酸激酶活性的关键结构，近年来研究发现，小分子可结合于JM的特异性抑制-结合口袋，该结合区域在Trk家族成员间高度可变，可据此开发高选择性的TrkA抑制剂[46]。有文献报道，Array公司开发的TrkA特异性抑制剂可与TrkA受体JM结构域特异性结合，对TrkA、TrkB及TrkC的IC50分别为2.7、1 303.7、2 483.7 nmol . L-1[47]，口服给药后可显著缓解骨关节炎导致的慢性疼痛。另外，Genzyme公司报道的一种TrkA抑制剂GZ389988，在链球菌多糖和单碘乙酸诱导的关节痛模型中可改善步态和缓解关节疼痛，目前其已完成Ⅰ期临床试验（NCT02424942）。

2.6 NGF/TrkA下游通路抑制剂

NGF与TrkA受体结合激活的下游信号包括Ras、Raf、丝裂原活化的胞外信号调节激酶、丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白激酶B等，在多种生理病理过程中具有重要作用。临床研究显示，据此开发的抑制NGF/TrkA下游信号通路的抑制剂具有一定的镇痛作用，但安全性较差。近年来又陆续报道了几个与NGF信号通路相关的靶标，以此开发的小分子抑制剂可能具有潜在的开发价值。其中1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是NGF下游信号分子之一，NGF/TrkA/S1P信号通路在化疗药导致的外周神经病理性疼痛（chemotherapeutic-induced peripheral neuropathic pain，CIPN）中具有重要作用，应用泛Trk抑制剂可部分缓解CIPN诱导的痛觉过敏[3]，鞘内给予1-磷酸鞘氨醇受体亚型1（sphingosine 1-phosphate receptor subtype 1，S1PR1）拮抗剂W146和FTY720可减弱CIPN模型大鼠神经炎症，缓解神经病理性疼痛，且不影响紫杉醇抗癌活性[48]。S1PR1拮抗剂FTY720对多发性硬化症诱导的神经病理性疼痛也具有良好的镇痛活性[49]。

3 结语

神经病理性疼痛多由神经损伤、代谢型疾病、感染等引起，涉及人群广，严重危害患者的生理及心理健康。NGF是一种重要的疼痛递质，在神经病理性疼痛中促进外周神经损伤诱导的炎症，通过调节多种离子通道受体和神经递质致敏伤害感受器，促进异位放电和交感神经芽生并间接促进中枢敏化。开发靶向NGF/TrkA信号通路的镇痛药物已成为当前研究的热点，目前已研发出多种单克隆抗体和小分子抑制剂用于治疗神经病理性疼痛，且多处于临床前或临床研究阶段。与阿片类镇痛药作用于中枢神经系统的特点相比，成年机体内NGF含量极低，抗NGF镇痛药物主要通过阻断外周疼痛信号传入以缓解疼痛，避免了对中枢神经系统的副作用，因此，以NGF为镇痛靶标开发新型镇痛药物，有望成为治疗神经病理性疼痛等慢性疼痛的新一代药物。尽管NGF在神经病理性疼痛中的作用受到了广泛的研究，但仍然存在许多问题有待探讨和解决，如TrkA和p75广泛分布于外周和中枢神经系统，NGF结合p75受体发挥促凋亡等作用，NGF结合TrkA受体促进细胞生存和生长，NGF在神经病理性疼痛中如何调节2种受体调控胞内信号通路以调节痛觉感受器功能还存在争议，其中TrkA和p75之间可能具有微妙的调节作用，不同细胞表征的NGF受体不同，或其他细胞的间接作用影响了NGF对不同受体的调节作用可能是探索解决该问题的方向之一。另外NGF具有抗炎和促炎的双重调节作用，如上所述在损伤导致的神经病理性疼痛中NGF可促进炎症细胞释放炎症因子进一步促进痛觉敏化，而损伤诱导的炎症汤是导致神经病理性疼痛产生和维持的关键因素，NGF在神经病理性疼痛炎症汤中的具体作用机制还需进一步探索。除致痛作用外，NGF还可促进伤口愈合、骨骼生长、神经修复和再生，抑制NGF可能会影响伤口愈合和神经系统功能，因此抗NGF治疗神经病理性疼痛需仔细监测其对神经系统、骨骼修复的变化影响，随时停药以避免更大的风险。