报春石斛种子萌发及原球茎的快繁培养条件研究

张梅 许冬月 朱自坤

摘 要：以报春石斛种子为实验材料，研究了基本培养基、外源激素的种类和浓度及光照对报春石斛种子非共生萌发及分化的影响。结果表明：报春石斛种子在光照条件下1/2MS培养基中的萌发率最高，达92.44%，且萌发时间最短;在1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA培养基中，原球茎的分化效果最佳。

关键词：报春石斛;非共生萌发;激素;培养基

中图分类号 S682文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）21-0027-03

Abstract：The aim was to study the culture conditions of seed germination and protocorm rapid propagation in Dendrobium primulinum.Using the seeds of D. primulinum as materials，the effects of the basic culture mediums，the type and concentration of exogenous hormones and the light on the non-symbiotic germination and subsequent differentiation were studied. Under the conditons of 1/2MS medium and light，the Dendrobium seeds had the highest germination rate of 92.44%，and the germination time was shortest. The protocorm differentiation effect was best in the 1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA medium.The study laid a foundation for the realization of the future industrial production of D. primulinum.

Key words：Dendrobium primulinum;Non-symbiotic germination;Hormone;Medium

报春石斛（Dendrobium primulinum Lindl.）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物。春季开花，姿態优美，花色艳丽多彩，花期长，耐温性强，作为盆花深受消费者的喜爱，具有极高的观赏价值[1]。石斛为合轴生长，分株是其繁殖的主要方式，但也存在周期长、繁殖率低、对生长条件的要求较为苛刻等缺点，不能满足国内外市场的需求[2]，加之人为的掠夺性采挖，导致其野生资源日益减少。

兰科植物种子虽多，但由于其不具有发育完全的胚，萌发率极低[3]，在自然条件下需要与真菌共生才可以萌发。当前，报春石斛的组织培养研究主要集中在茎段和茎尖再生体系[4-6]与种子非共生萌发[7-8]方面。本研究从不同的培养基、不同激素的配比、光照3个组培基本条件，对报春石斛兰的非共生萌发及原球茎分化条件进行了研究，以期为实现利用种子萌发技术扩大报春石斛繁殖提供理伦依据。

1 材料与方法

1.1 材料 选用云南屏边大围山野生报春石斛成熟的未开裂蒴果内种子。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 将报春石斛兰蒴果用流水冲洗干净，在超净工作台中用90%酒精仔细擦拭果荚表面，再用75%酒精中浸透，置于酒精灯上灼烧，重复3次。

1.2.2 培养基萌发诱导培养 在超净工作台上，用无菌的解剖刀将消毒后的蒴果纵向剖成两半，用无菌镊子将种子挑出放入无菌水中混合，用消毒后的针筒吸取少量的种子，均匀的撒在KC、改良KC、1/2MS、1/4MS、MS、N6等6种培养基表面。每种培养基接种20瓶，并用放大镜统计各瓶接种种子数，分成2批，一批的培养条件为光照12h/d，光照强度为1500lx，温度为（25±2）℃;另一批为暗培养。每天观察种子萌发情况，记录最早萌发时间及培养30d的生长状态，萌发的标准为出现白色原球茎。

1.2.3 外源激素萌发诱导培养 种子萌发生长形成原球茎后，将原球茎转接在添加不同浓度6-BA、NAA的培养基中，观察原球茎在不同激素浓度下的分化情况。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对种子萌发的影响 从表1可以看出：在未添加任何植物激素的情况下，光照培养10d时，在1/2MS培养中的萌发率最高达92.44%，并且萌发所需时间最短;而在KC培养基中的萌发率最低，仅为35.42%。光照培养与暗培养对报春石斛兰种子萌发的影响是有差异的，暗培养条件下的萌发率降低。不同培养基萌发率的从高到低依次为1/2MS>1/4MS>MS>N6>改良KC>KC。接种30d后，原球茎的生长表现差异明显，KC和改良KC培养基中萌发率最低，萌发后的种子未形成原球茎，慢慢死亡。其他培养基中的原球茎均有所生长，在N6和MS培养基中的部分原球茎膨大分化，有小部分种子萌发后就没有形成原球茎。在1/2MS与1/4MS培养基中的原球茎大部分已分化，但1/4MS培养中形成的原球茎在后期出现颜色偏黄。

2.2 光培养和暗培养对种子萌发的影响 在光照培养和暗培养条件下，种子均能萌发，但在同一个培养基上，光照条件下的萌发率明显高于暗培养条件下的，并且原球茎的生长状态较好。在光照培养条件下，1/2MS培养基中的种子萌发率最高，萌发时间短;而在黑暗条件下培养时培养到第20天时种子才萌发，萌发率由92.44%降低至56.36%，并且原球茎细小瘦弱。试验结果表明，光照条件下种子萌发时间比暗培养条件下所需的时间短，萌发率提高。接种30d后，在同一个培养基中，暗培养下的原球茎生长状态比光照培养下的差，并且原球茎小，生长缓慢，颜色偏黄。

2.3 激素对原球茎分化的影响 种子在培养基中形成原球茎时，将其接种与不同浓度的NAA和6-BA的1/2MS培养基中，结果显示，原球茎的分化并不是随着6-BA浓度的增加，效果就越来越好（表2）。在培养基中添加0.2mg/LNAA和0.5mg/L6-BA时原球茎分化较快，长势最好，培养30d时，原球茎已分化出小苗，部分小苗长出根，小苗顶端有3～4片小叶。不添加任何激素的情况下，原球茎也能分化出小苗，但所需时间长。培养基中细胞分裂素浓度大于生长素浓度时，较有利于原球茎的分化。8号培养基（0.2mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）和12号培养基（0.2mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）的原球茎分化速度快，但分化形成苗较小。不同植物对激素浓度的比例要求有所不同，当细胞分裂素浓度过高时，会影响原球茎的分化。

3 讨论

3.1 培养基 兰花种子的胚发育不完全，自然环境下萌发困难，通常需要与真菌共生才能萌发，利用不同的培养基进行非共生萌发，能够快速促进种子萌发。在本试验中，用KC、改良KC、1/2MS、1/4MS、MS、N6培养基对报春石斛兰种子进行培养，结果表明，种子在1/2MS与1/4MS培养中萌发率最高，分别为92.44%、90.27%，且萌发需要时间短。不同的培养基对种子萌发的影响，可能是由于培养基中所含的元素不同导致。本次研究结果与毛秀华[9]、余乐[8]等进行的石斛种子萌发试验结果相似，降低无机盐浓度有利于种子的生长和萌发，而与周华伟报道的石斛种子萌发需要无机盐浓度很高的培养基是不一樣的[10]。

3.2 光照 植物种子的萌发除受种子内部生理特性和培养基等条件的影响外，还受到了外部环境因素的影响。不同的兰花种子萌发对光照要求不同，有些兰花则光照培养反而会抑制其萌发，进行暗培养后会提高萌发率，比如加入活性炭为种子萌发创造黑暗，也是黑暗培养的一个手段。本试验中，通过对报春石斛种子在光照和黑暗条件下相同培养基中进行萌发比较发现，种子在光照和黑暗条件下均能萌发，只是在光照条件下的萌发率高，生长速度快，原球茎分化正常。在本试验中也发现新的试验现象，在同一批次的种子中，报春石斛兰果荚中会有小部分的未发育成熟的种子，在光照培养过程中并未萌发，但种子并未死亡。经过暗培养后，在后期种子开始萌发。

3.3 不同激素的配比 种子萌发形成原球茎时，对激素的需求会变得越来越敏感，分化程度会越来越明显。研究结果显示，添加适宜的激素可以促进原球茎的分化，当在1/2MS培养基中添加0.2mg/LNAA、0.5mg/L6-BA时，原球茎分化最快，此时2种激素的比例达到最佳，这与余乐等研究结果相似[8]。而细胞分裂素过高则会影响原球茎的分化和生长，高浓度细胞分裂素下的原球茎发黄，分化出的小苗是黄绿色的。

研究发现，影响报春石斛种子萌发的因素除了上述几个方面以外，还有糖浓度、酸碱度（pH）、维生素、天然复合物（椰乳、香蕉泥、苹果汁、马铃薯、蛋白胨等）、遗传因素及光照等[11]。此外，研究者还发现，兰花种子的萌发与种皮致密，透气性差或种皮含有抑制物有关[12]。阻碍兰科植物种子萌发的机制较复杂，还有待进一步研究。因此，今后有必要从多维的角度去认识和研究这一试验现象。

报春石斛兰种子数量多，快速繁殖可利用这一优势，利用种子进行非共生萌发，进行不断的分化和增殖，产生种苗，这一途径是兰花种苗工厂化生产的重要途径。本文探讨了报春石斛种子非共生萌发及形成原球茎分化的最适条件，为工厂化生产奠定了一定的基础，对其快速繁殖具有一定的参考意义。

参考文献

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[12]范成明，李枝林，何月秋.兰花组织培养及分子生物学研究进展[J].园艺学报，2003，30（4）：487-491. （责编：张宏民）