高粱炭疽病抗性机理研究进展

邓小锋， 彭 秋， 李青风， 刘天友

(贵州省农业科学院 旱粮研究所， 贵州 贵阳 550006)

高粱〔Sorghumbicolor(L.)Moench〕是世界第五大作物，广泛用于饲料、粮食、酿造加工和能源等行业。高粱炭疽病是世界性病害，近年来，其流行区域不断扩展，我国各高粱主产区，包括贵州省的栽种区均有发生，且病情严重，给高粱品种选育带来巨大压力。目前国内外专家学者已对该病害进行了大量研究。以高粱作原料的白酒酿造是贵州省的支柱产业之一。目前，贵州省高粱种植区主要位于遵义、仁怀、金沙和安顺等市县，2018年全省高粱种植面积不少于8.67万hm2，包括4万余hm2有机高粱[1]，品种几乎都是当地的常规高粱品种。现今除外省选育的一些杂交糯高粱品种对炭疽病有一定抗性外，贵州省内常规糯高粱品种几乎对炭疽病都没有稳定抗性。现全省除贵州省农业科学院已开展炭疽病相关研究外，还未见其他单位有相关研究报道。贵州省内生产的高粱主要作为酿酒原料，但省内选育的高粱优良品种数量少，杂交种更少。开展高粱炭疽病抗性研究和抗性育种对满足贵州省白酒酿造产业对绿色、有机高粱原料的不断需求，推动贵州省山地农业的发展及高粱生产向“高效、绿色、有机”方式的转变具有重大意义。鉴于此，对20世纪80年代以来国内外有关高粱炭疽病抗性机理的研究进行梳理，从高粱炭疽病危害特征、抗性资源鉴定、病原菌侵染机理、抗性机理及抗性育种等方面进行总结，以期为贵州省相关领域研究和高粱育种提供借鉴，并为高粱产业的进一步发展提供参考。

1 高粱炭疽病的危害特征

高粱炭疽病是由禾生炭疽菌(ColletotrichumsublineolumP. Henn.，Kabát and Bubák)侵染导致的病害，1902年在西非首次报道，各国高粱栽种区均有发生。该病害在高温潮湿地区易流行，是高粱最具毁灭性的病害之一[2-3]，病害严重发生时感病品种籽粒和茎秆产量减产达67%，其中，籽粒产量减产36%[4]。近年来，该病害在贵州高粱栽种区发生趋势加重。

高粱生长发育各阶段炭疽菌都能侵染其所有地上组织，其中，以叶部病害最为常见，病症先从下部叶片开始出现，且孕穗期症状开始明显。即在叶片上出现细小圆形、椭圆形、方形的斑点或细长病变，有红色、褐色或者黑紫色边缘；随着病情发展，感病品种的病斑上出现黑色小点，即炭疽菌分生孢子盘，周围的组织逐渐死亡并连成片，最终使叶片枯萎，叶片的光合作用与物质合成能力逐渐丧失。分生孢子可通过水流或气流传播至附近的叶片上进行危害；此外，带菌种子也是重要的传播方式[5]。田间高粱叶片和茎秆残体中的菌核是主要的初侵染源[6]。

2 高粱炭疽病抗性资源的鉴定

在高粱生产上要实现高产、优质的目标，对区域内主要病害炭疽病的研究和监测是一项必然要求，此外取决于高粱品种本身的生产潜力，特别是抗病稳定性。CHALA等[7]研究发现，炭疽菌的遗传多样性丰富，存在不同的生理小种，选育对多个生理小种有稳定抗性的高粱品种比较困难，因此鉴定筛选对种植区生理小种有稳定抗性的高粱材料或品系是进一步开展研究和品种选育的基础。国际半干旱作物研究中心于1982—1991年先后对1.3万余份资源和品系进行鉴定发现，有11个材料在印度和非洲多年表现出对高粱炭疽病的稳定抗性[8]。美国国家植物种质库保存有4.3万余份高粱资源，美国农业部热带农业研究站、南方平原农业研究中心从2003年起，持续对多份资源进行系统鉴定发现，抗性资源绝大部分来源于非洲国家[9-15]。姜钰等[16]从2013年开始对我国北方高粱育种上广泛应用的优良高粱种质资源或品系进行鉴定，从中筛选得到抗炭疽病材料51份。PROM等[17]采用18个高粱品种作为鉴定系统进行不同生理小种的鉴定。

炭疽菌菌株间遗传多样性丰富，不同地理位置区域内的炭疽菌存在多个专化型或生理小种，且同一地理位置区域内的菌株间异质性也很高[17]。目前，虽然已经测定炭疽菌的基因组序列[18]，但还未见有关菌株间高异质性原因的研究报道。

贵州省农业科学院旱粮研究所在鉴定高粱炭疽病抗性资源方面做了一些工作，先后收集了多份贵州地方高粱资源，并选送资源到吉林鉴定中心进行鉴定；同时，与贵州省农业科学院品种资源研究所合作，陆续对收集的地方资源进行抗性鉴定，并得到一些高粱抗病材料[19]。但贵州省内缺乏一套可行的高粱鉴定标准系统，相关研究与育种还远不能满足贵州省内高粱产业的发展需求。目前，未见有关贵州高粱种植区高粱炭疽病调查、炭疽菌遗传多样性及生理小种方面的研究报道，也未见有关贵州省高粱品种炭疽病抗性系统鉴定的报道。

3 高粱抗炭疽菌侵染的机理

3.1 抗性反应

炭疽孢子在高粱叶片上一般9～12 h后开始侵染。先萌发形成附着胞，然后穿入叶片表皮细胞的细胞壁和膜形成侵染囊泡。若宿主有抗性，2～3 h后受侵染细胞和邻近细胞开始积累高浓度3-脱氧花色素；若无有效抗性，侵染囊泡接着发展出主菌丝和次生菌丝侵入邻近的表皮和叶肉细胞，最后形成分生孢子盘。

NICHOLSON等[20]于1987年在细胞囊泡的内含物中首次发现3-脱氧花色素，其是一类植物抗毒素。内含物破裂后3-脱氧花色素被释放到细胞中抑制炭疽菌的生长[21]，或者杀死真菌和植物细胞本身，阻止其向临近细胞侵染[22-23]。目前已鉴定出高粱中含有至少5种3-脱氧花色素：芹菜定、木樨黄定、5-氧芹菜定糖咖啡酸酯、5-甲氧基木樨黄定和7-甲氧基芹菜定[24]。抗病材料和感病材料积累的3-脱氧花色素种类或者浓度不同。NICHOLSON等[20]发现，某些抗病材料的细胞可积累芹菜定和木樨黄定2种3-脱氧花色素，而感病材料细胞只能积累芹菜定。WHARTON等[24]研究发现，一些感病材料的表皮细胞虽然也分泌囊泡内含物，但颜色浅、3-脱氧花色素浓度低，对病菌的生长没有明显抑制作用；在某些感病品种中未检测到木樨黄定和5-甲氧基木樨黄定。LO等[25]研究证明，木樨黄定和5-甲氧基木樨黄定2种植物抗毒素对真菌的毒性大于芹菜定、5-氧芹菜定糖咖啡酸酯和7-甲氧基芹菜定。从时效看，一些感病材料应答时间晚，受侵染后66 h才合成3-脱氧花色素；而抗病宿主在侵染囊泡刚形成时细胞内就开始产生含高浓度3-脱氧花色素的内含物[22-23]。

BASAVARAJU等[26]发现，高粱对炭疽菌的抗性反应，细胞除合成3-脱氧花色素外，还可合成H2O2及富羟脯氨酸糖蛋白(Hydroxyproline-rich glycoproteins，HRGP蛋白)。炭疽孢子侵染囊泡刚穿透宿主细胞壁，抗性材料宿主细胞就合成H2O2和3-脱氧花色素阻止病菌增殖，而感病材料在接种后第5天才合成H2O2，导致叶片组织坏死。HRGP蛋白作为植物细胞壁的重要组成部分，病菌侵染时会被诱导合成，加强细胞壁的结构，是一种快速防御机制[27]。BASAVARAJU等[26]还发现，高粱受炭疽孢子侵染位置的细胞壁可形成乳突、胼胝质沉积和蛋白质交联；只在抗性材料中观察到HRGP蛋白。抗性和半抗性材料中形成乳突、胼胝质沉积和蛋白质交联的现象明显多于感病材料。

黄酮类物质在宿主防御体系中起着重要作用。如高粱植株受炭疽菌侵染20 h后，可检测到黄酮Apigenin(芹菜素)和Luteolin(木犀草素)的积累，其能显著抑制炭疽孢子的萌发[28]。

已有研究表明，植物防御炭疽菌侵染包括合成3-脱氧花色素、H2O2、HRGP蛋白及黄酮类物质，细胞壁形成乳突、胼胝质沉积和蛋白质交联等多种方式。抗病和感病材料的差异表现在能否快速合成上述物质或形成类似结构。感病材料对抗炭疽菌侵染存在2种情况，一是细胞合成的防御物质种类少或者浓度低，无法有效地杀死或阻止炭疽菌；二是完全无法合成防御物质，推测其原因可能是相关功能基因的无效突变，或入侵炭疽菌能够抑制宿主细胞的信号转导系统，使宿主细胞无法及时调控下游防御系统功能基因的表达。

3.2 应答胁迫分子机理

代谢组学分析显示，高粱受炭疽菌侵染后，合成最多的次生代谢产物是类黄酮化合物、苯丙烷类代谢途径化合物及色氨酸代谢途径化合物[29]。类黄酮化合物包括花青素、3-脱氧花色素和黄酮类3种。3类物质的合成从共同的前体Naringenin(柚皮素)开始。该类化合物的合成途径是苯丙烷类代谢途径的一个分支，通过研究确定了多个反应步骤的酶，许多酶的编码基因已经克隆。总结前人研究的结果发现，类黄酮化合物合成有4条途径(图1)[30]：花青素合成途径(A)、3-脱氧花色素芹菜定合成途径(B)、木犀黄定的合成途径(C)及黄酮类物质芹菜素和木犀草素的合成路线(D)。

由图1看出，查尔酮在查尔酮异构酶的催化下转变为柚皮素后，在后续不同酶的调控下，分别合成花青素、3-脱氧花色素和黄酮，以满足自身生长和抵御外界生物胁迫的需求。正常光照条件下，植物合成花青素，而3-脱氧花色素的合成不需要光照[31-32]。当光照和病菌侵染同时存在时，植株先合成3-脱氧花色素，而抑制花青素的合成。研究显示，参与该合成途径的酶基因PAL(Phenylalanine ammonia lyase，苯丙氨酸氨裂解酶)和CHS(Chalcone synthase，查尔酮合成酶)的表达上调，而负责合成花青素的酶基因F3H(flavanone 3-hydroxylase，黄烷酮3-羟化酶)、DFR(dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇4-还原酶)和ANS(anthocyanidin synthase，花青素合成酶)的表达被抑制，从而应对病菌的侵染[31]。虽然F3’H(flavonoid 3’-hydroxylase，类黄酮3’-羟化酶)同时参与花青素和3-脱氧花色素的合成，但该基因家族不同成员执行不同角色。已克隆的2个F3’H基因，1个参与光特异性的花青素的积累，1个参与特异性病害反应的3-脱氧花色素的合成[33]。对炭疽菌不同抗性品种2个基因表达模式不同。遭受侵染时，抗性品种CHS和PR-10(pathogenesis-related protein，病程相关蛋白)基因的上调表达更早[34]，而感病品种2个基因的表达于侵染后24 h开始，但其他非致病菌侵染时，2个基因的表达于侵染6 h后开始[35]。据此推测，炭疽菌对感病品种调控该途径的信号传导系统有抑制作用。

图1 类黄酮化合物的合成途径

从生化和分子层面的研究结果看出，类黄酮物质及其合成途径、上游信号途径和合成步骤相关酶基因的表达调控途径是高粱防御炭疽菌侵染的核心组分之一。MIZUNO等[36]报道，高粱叶片在切割胁迫后边缘至少可以呈现3种颜色：紫色、棕褐色和浅棕色，其均与类黄酮物质合成途径的缺陷有关。若高粱材料只合成3-脱氧花色素，不能合成黄酮，则呈紫色，其对应基因FNSII的无效突变；能正常合成2种黄酮，不能合成3-脱氧花色素，则呈棕褐色，其对应基因FNR的无效突变；若只能合成1种黄酮芹菜素，不能合成木犀草素则呈浅棕色，对应基因F3’H和FNR的无效突变。该研究虽然没有鉴定试验高粱材料对炭疽菌的抗性，但首次分析了3-脱氧花色素与黄酮合成途径参与基因的无效突变情况，在分子层面解释了某些感病材料形成的原因。可见，试验中的高粱材料合成的类黄酮物质与正常的材料相比有所缺失，因此，其抗性会弱于正常材料。

H2O2及HRGP蛋白合成途径的研究较3-脱氧花色素的少，其功能基因、信号转导和调控途径信息等目前尚不清楚。对参与防御炭疽菌入侵的转录因子基因的研究内容也较少，现发现转录因子基因Y1参与调控3-脱氧花色素的合成，Y1蛋白调控CHS、CHI(chalcone isomerase，查尔酮异构酶)和DFR基因的表达[38]。

3.3 抗性相关基因的基因组定位

为研究高粱抗炭疽病原理，定位抗性相关基因，进而提高抗性育种效率，许多研究者对抗性进行遗传分析、抗性基因连锁分析和基因组定位。MEHTA等[38]的研究显示，抗性性状既有显性也有隐性，许多材料，如G73、Redlan、SC748-5、Bk7、SC155-14E和SC414-12E的抗性均由主效QTL控制[39-43]。与这些材料的抗性基因连锁的分子标记也被开发用于品种选育，如对G73设计的SCAR(sequence characterized amplified region，序列特异性扩增区)标记[39]，SC748-5关联的AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)和SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)标记[41]。利用分子标记的初步定位显示高粱基因组中存在一些抗性基因富集的区段，其与炭疽病的有效抗性有关[42-44]，但该区段中哪些基因参与抗病过程目前还不清楚。

CUEVAS等[45]对包含335个核心高粱材料的群体进行关联分析，定位了基因组中5个炭疽病抗性相关基因，是除参与3-脱氧花色素、黄酮及病程相关蛋白合成途径的基因外，首次发现与炭疽病抗性有关的基因。这些基因分别位于1号和5号染色体上，为R家族基因和免疫反应相关基因，分别编码F-box结构域蛋白、蛋白酪氨酸激酶、葡萄糖醛酸转移酶和过氧化物酶等。

4 对高粱炭疽病抗性研究与育种的思考

4.1 抗性研究

高粱对炭疽菌侵染反应的相关研究主要集中在宿主细胞形态研究、类黄酮化合物的合成及合成途径的功能基因鉴定、定位，其他方面，如信号转导与防御反应的基因表达调控层面的研究较少。信号转导层面，只确定1个蛋白酪氨酸激酶(Sobic. 005G182400)[45]；转录因子方面，只确定基因Y1参与调控3-脱氧花色素的合成。对信号转导和表达调控的研究，可从高粱对炭疽反应的转录水平分析入手，以揭示炭疽菌侵染早期抗病材料分子水平的反应。炭疽孢子萌发后侵入细胞的2～3 h是关键时段，在该时段内抗性材料通过信号转导和调控基因表达进行有效防御反应；感病材料或是因为基因缺陷，或是转导与表达调控途径被入侵病菌抑制而无法合成足够的物质或形成相应的结构开展有效防御。对该时段转录水平的分析可以找到更多的参与信号转导的基因与调控下游功能基因表达的转录因子基因。除3-脱氧花色素外，H2O2及HRGP蛋白合成的信号转导与表达调控途径也值得研究，并将进一步在分子水平揭示高粱的抗性机理。

黄酮类物质3-脱氧花色素和黄酮均对炭疽菌有毒性作用。高粱中至少有5种3-脱氧花色素，是否存在对炭疽菌有毒性的其他3-脱氧花色素及黄酮类物质还有待进一步研究。已鉴定或者克隆的参与3-脱氧花色素合成途径的基因有F3’H和FNR，参与黄酮化合物合成的基因有FNSII和F3’H。从无色芹菜定转变为芹菜定，叶黄素转变为木犀黄定，催化该转变反应的关键酶及其编码基因尚未确定；此外，是否还有其他酶参与该合成途径，通过对多个高粱材料的对比研究有望得到更多信息。

针对贵州省主要高粱栽种区炭疽菌的不同生理小种，需要对更多高粱资源的抗性性状进行重复鉴定，为进一步研究和育种创造材料。同时，进一步实践和完善田间及实验室鉴定方法，不同生育期的鉴定方法及其成效。在生化层面和分子层面完善高粱应对胁迫反应的标志性化合物的检测技术，如对各种3-脱氧花色素、黄酮、H2O2和HRGP蛋白的检测技术，使其能适应检测大群体样本、快速及准确的需求，进而推动该领域迅速发展。另外，使用连锁分析、关联分析等方法定位不同材料之间抗性相关的具体基因，阐述抗性在材料间差异的分子机理。已有研究中使用连锁分析方法确定了一些材料中抗性相关基因的连锁标记[39，41-44]，但由于使用的群体小，均未能定位到具体的基因。

4.2 抗性育种

虽然防治高粱炭疽病的措施多种多样，但选育稳定的抗病品种仍是最经济的方法。育种时应针对当地的生理小种，尽量选择遗传多样性丰富的抗性材料。对于抗性基因位于基因组不同位点的材料，可结合分子标记技术进行基因聚合，使选育品系的抗性更稳定和持久；同时，结合其他农艺性状，如产量、丹宁含量、糯质、穗形及株形等，用回交等方式将抗性性状转移到品系中。为加快品种选育过程，还需要先确定材料中抗性相关基因的各种连锁标记，以确保其在不同病害选择压力的环境中正常使用。此外，可选育多个不同遗传背景的抗性品种进行混合种植，以降低炭疽菌生理小种的变异速率。