环状RNA在结直肠癌中的研究进展

张宇宏，李云龙，李胜龙综述 张博淼，黄跃南审校

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤，全球范围内癌症发病居男性的第2位，女性的第3位[1]。当结直肠癌被检出时在局限阶段的5年生存率为90.1%，癌症扩散到临近器官和淋巴结时5年生存率下降到69.2%，当疾病扩散到远处器官时，5年生存率下降到11.7%，然而只有39%的患者在癌症局限阶段被检出[2]。因此寻求更有效的早期诊断和治疗方式一直是近年来结直肠癌研究领域的热点。环状RNA(circular RNA，circRNA)最早被发现于1976年，在这之前一直被当作剪辑错误，后被证明是生物体内存在的广泛多样的内源性非编码RNA[3-4]。越来越多的研究表明，环状RNA在许多疾病的发生发展中具有重要作用，尤其是在结直肠癌中，与结直肠癌的分化、TNM分期及侵袭和转移相关。筛选特异性环状RNA可以为结直肠癌提供一个非侵入性的、敏感的诊断方式。深入研究环状RNA与结直肠癌的关系可以为治疗结直肠癌提供一个新方向。本文将结合环状RNA的生物起源和作用机制，以及结直肠癌研究的最新进展进行综述，希望对未来结直肠癌的早期诊断和治疗提供些许帮助。

1 环状RNA的生物起源和生物学特性

1.1 环状RNA的生物起源 环状RNA最初发现于1976年，之后一直被科学界认为是一种剪辑错误的副产物[3-5]，随着研究的深入以及二代测序技术和分子生物学的发展，大量差异表达的环状RNA被发现，目前发现的环状RNA总量巨大，环状RNA的形成机制和生物功能也逐渐被揭开。环状RNA是一类长链非编码竞争性内源RNA，它是一种无5'-3'结构和Poly A尾的闭合共价的环状结构[5]。闭合的环状结构使环状RNA结构稳定，可以抵抗RNA酶的降解，大多数环状RNA的半衰期都在48 h以上，并且广泛大量存在于组织和外周血中，为其成为潜在的分子标志物提供了可能性[6-7]。与线性RNA的形成不同，环状RNA主要由外显子的反向剪辑和跳跃形成[8]。新产生的环状RNA一般比线性RNAs晚，这表明大多数环状RNA是在亲本基因转录后产生的[9]。目前关于环状RNA形成方式主要有以下几种：(1)套索结构内含子的直接环化；(2)由套索机制驱动的环化；(3)内含子配对介导的环化反应；(4)由RNA结合蛋白介导的环化反应；(5)由转运RNA剪接驱动的环化；(6)由核糖体RNA剪接驱动的环化[7, 10]。

1.2 环状RNA的生物学特性 环状RNA作为最近研究的热点，其独特的生物学特性也逐渐被科研人员所认识。主要有以下几个特性：(1)稳定性。与其他类型的RNA不同，环状RNA首尾相连形成环状结构，没有poly A尾结构，可以抵抗核酸酶的分解，与其他类型的RNA相比，环状RNA结构更加稳定[11]。(2)保守性。环状RNA具有序列保守性，这一特性使其在研究人员做研究时更为准确[7]。(3)大量表达。环状RNA在哺乳动物体内大量表达，通过高通量测序目前已经发现超过100万个环状RNA，某些环状RNA的表达甚至比相应的线性RNA更多，并且在很多疾病中丰度明显增加[7, 12]。环状RNA数量庞大，形成方式又较为多样，虽然目前已经成为最新的科研热点并且解开了环状RNA的部分特性和功能，但仍然需要更深入的研究去了解它的生物学特性。

2 环状RNA的功能

2.1 作为微小RNA的分子海绵 目前研究得到的环状RNA功能主要是微小RNA(microRNA，miRNA)的分子海绵，通过影响微小RNA的功能进而影响相应靶基因的表达。环状RNA上存在大量微小RNA结合位点，可以与微小RNA相互结合，通过海绵吸附作用抑制微小RNA的表达，进而调控细胞内信号传导通路以及目的基因的表达[13]。Memczak等[14]研究发现，环状RNA可以形成一类重要的转录后调节，环状RNA主要通过调节RNA及RNA结合蛋白和其结合位点局部游离浓度，进而与其他RNA竞争结合微小RNA和RNA结合蛋白，成为一种转录后调节因子。以最近研究的环状RNA circ-ITCH为例，circ-ITCH在膀胱癌中表达下调，并且低表达的circ-ITCH与膀胱癌患者较差的生存期相关，经验证circ-ITCH通过对miR-17和miR-224的分子海绵作用，上调miR-17和miR-224的靶基因p21和PTEN的表达，进而参与相关信号传导通路的调节[15]。circ-ITCH在肺癌的发病中，通过分子海绵功能参与Wnt/beta-Catenin信号传导通路进而抑制肺癌的发生。其在肝癌、食管鳞状细胞癌以及卵巢癌等众多恶性肿瘤中也发挥相类似的分子海绵作用[16-18]。

2.2 环状RNA的其他功能

2.2.1 蛋白质结合功能：环状RNA可以通过特定靶点与蛋白质结合，进而影响蛋白质的功能。有研究表明，环状RNA circ-Foxo3可以作为调试器调节周期蛋白依赖激酶2(CDK2)和蛋白质p21之间的关系进而调节蛋白质-蛋白质相互作用网络[19-20]。Holdt等[21]的研究发现了环状RNA一个新的功能，circANRIL通过与核糖体蛋白相互作用抑制核糖体RNA的成熟。环状RNA还可以与阿格蛋白(argunaute，AGO)结合，进而调控mRNA的转录和翻译过程[14]。蛋白质的功能多种多样，有研究揭示环状RNA与蛋白质之间具有相互作用，对于未来蛋白质领域的研究也具有深远影响。

2.2.2 调节基因表达功能:环状RNA参与生物体内遗传信息的转录和剪辑过程。环状RNA可以在与普通mRNA的剪切竞争过程中影响靶基因的表达，可见环状RNA的上调和下调可以不同程度影响其亲本基因的表达[22- 23]。Petkovic等[24]的研究表明动物体内RNA的环化与前体mRNA有竞争抑制关系，以保证组织特异性基因的表达。可见环状RNA在调节基因表达中也发挥作用。

2.2.3 翻译功能:环状RNA携带遗传信息可以行使翻译功能。最近一项研究表明，乙型肝炎病毒的卫星病毒δ病毒、HBV和HDV的包囊以一个非常规的方式共同产生一个122个氨基酸的病毒蛋白，这项研究支持在哺乳动物体内自然产生的环状RNA可以被转录成蛋白质的假设[25]。研究还发现环状RNA具有编码多肽链的能力[15]。这个突破性的发现，打破了一直以来人们对于环状RNA从无功能的转录副产物到有功能的调节转录因子的认识，环状RNA可能也具备核酸的翻译特性。

随着研究深入，越来越多的功能逐渐被科研人员认识，对于环状RNA的定义也逐渐得到更新。这些研究扩展了人们的知识，从序列配对的调节器(微小RNA海绵和竞争剪辑)到结构功能类似的蛋白质类调节物质，甚至到作为转录本翻译蛋白质，未来更多的环状RNA功能将逐步被科学界解开，为疾病的早期诊断以及靶向治疗提供新的探索方向。

3 结直肠癌与环状RNA

科学界对环状RNA研究在近20年里突飞猛进，二代测序技术以及生物信息学的发展，越来越多的环状RNA被发现于疾病相关，包括良性心血管疾病、内分泌疾病以及恶性肿瘤等[26-27]，尤其环状RNA与结直肠癌的关系也成为研究热点。目前关于环状RNA和结直肠癌诊断和治疗的研究已经取得一些成果。

3.1 环状RNA在肿瘤发展和侵袭中的作用 环状RNA在结直肠癌中有显著的丰度变化，并且与肿瘤转移、侵袭、淋巴结转移以及预后等特征密切相关。与正常对照组相比，在结肠直肠癌中，circHIPK3明显过度表达。实验研究表明，circHIPK3可以通过隔离多个微小RNA来调节人体细胞的增殖[13]。Bachmayr-heyda等[28]发现与正常组织比较，结直肠癌细胞株和结直肠癌内环状RNA的丰度少，而环状RNA的丰度与细胞增殖呈负相关。Wang等[29]的研究表明,Hsa_circ_0000567在结直肠癌组织和癌旁组织中均显著下调，并且其下调与肿瘤的大小、淋巴结转移、远端转移和TNM分期均呈负相关。敲除Hsa_circ_0000567可以促进体外培养的结肠癌细胞增殖和迁移。另一项研究表明，Hsa_circ_0014717在结直肠癌组织和细胞系中表达均下调，并且表达水平与结直肠癌患者的TNM分期、淋巴结转移和预后显著相关，过表达Hsa_circ_0014717可以显著抑制CRC细胞增殖和集落形成，并诱导体外CRC细胞分化停滞在G0/G1阶段，并上调细胞周期抑制蛋白P16的表达进而参与细胞周期的调节[30]。Ji等[31]对结直肠癌组织中环状RNA进行分析得出，相比较正常结直肠组织，Hsa_circ_001649在结直肠癌组织和CRC细胞系中表达显著下调，虽然该研究显示Hsa_circ_001649与性别、年龄、TNM分期以及CEA CA119-9和CA-724无相关性，但值得关注的是在CRC患者手术前和手术后的血清样本中检测到术后Hsa_circ_001649的含量显著上调，并且与分型显著相关。Zhuo等[32]研究中circRNA0003906在6种CRC细胞系中和122对CRC癌组织和癌旁组织进行即时聚合酶链式反应，结果circRNA0003906的表达均下调，并且与淋巴转移和较差的病理分型密切相关。最近的研究报道表明，circRNA的水平在KRAS突变的结肠癌细胞中显著减少，并可被输送到外体，这表明了circRNA可能参与了结肠直肠癌的肿瘤形成[33]。

可见环状RNA与结直肠癌的发生发展密切相关，有望作为结直肠癌诊断和预测预后的分子标志物，成为结直肠癌基因治疗的一个新突破。

3.2 环状RNA参与结直肠癌内信号传导通路并影响肿瘤功能 环状RNA可以通过参与肿瘤内相关信号传导通路影响肿瘤的发生发展。在动物模型中，来自人类肿瘤异种移植的环状RNA的数量与肿瘤大小有关。这些数据为研究人员提供了一种新颖独特的方法，可以将外体环状RNA应用于结直肠癌的早期发现和预后。细胞内的环状RNA和细胞外的环状RNA水平相关，并且环状RNA在细胞内外的转移与微小RNA相关，提示环状RNA与其他调节物质共同参与信号的转导[13]。Zhu等[34]在对3对CRC癌组织和癌旁组织的测序和分析得出，136个显著表达和243个显著下调的环状RNA，并验证了基因BANP上5～11个外显子产生的环状RNA并命名为circular BANP。在35个CRC癌组织中，用si-circ-BANP转染CRC细胞可以抑制p-Akt的表达，这为circular BANP参与PI3 K/Akt信号传导通路的假设提供了证据。Xie等[35]的研究显示hsa_circ_001569在细胞增殖和结直肠癌侵袭中发挥正性调节作用,hsa_circ_001569被证实是miR-145的分子海绵上调miR-145的功能靶基因E2F5、BAG4和FMNL2。在结直肠癌组织中，circ_001569与miR-145呈负相关，而miR-145与E2F5、 BAG4 和 FMNL2的表达呈负相关。Zhang等[36]发现hsa_circRNA_103809 和 hsa_circRNA_104700在CRC组织中均显著下调，hsa_circRNA_103809 与淋巴转移和TNM分期显著相关，而hsa_circRNA_104700与远端转移相关。Huang等[37]发现环状RNA Circ-ITCH在结直肠癌中表达下调，并通过参与调节Wnt/beta-catenin信号传导通路而参与癌症的调节。环状RNA对微小RNA发挥的海绵作用，可以作为一个控制结肠癌细胞功能的手段，也就是环状RNA在肿瘤治疗方面的潜在应用。

3.3 环状RNA是潜在的结直肠癌靶点 越来越多的证据显示了各种新型的环状RNA和致癌基因的信号通路之间的关系，或者是对结直肠癌细胞具有侵略性和特异性的操纵，这两者都为未来开发新药物提供靶点及研究方向，以提高结直肠癌患者的早期诊断率以及存活率。已有的研究证明环状RNA确实参与了结直肠癌疾病发生发展的细胞内信号传导通路，未来还有待更深入地研究探索其具体机制并应用于临床。Hansen等[38]首先在小鼠大脑组织里发现可以吸附到miR-7上作为miR-7的分子海绵，并命名为ciRS-7。miR-7是一个目前研究较为深入的分子，是多个肿瘤相关的信号传导通路中的关键分子，通过PTEN/PI3K/AKT信号传导通路调节胃癌的发生发展[39]。另一项研究表明，ciRS-7下调可以抑制EGFR和IGF-1R的表达，释放更多的miR-7，从而显示出显著的肿瘤抑制活性[40]。miR-7还是在结直肠癌肿瘤发生过程中的一个关键分子。ciRS-7可以绑定到miR-7的目标序列，所以它可以充当微小RNA的海绵抑制miR-7的功能。因此，笔者推测，对ciRS-7的下调可以增强miR-7的肿瘤抑制功能，从而抑制结直肠癌的发展。总之，考虑到ciRS-7在隔离miR-7和积极调节EGFR/RAF1/MAPK信号通路中的重要性，通过调节ciRS-7/miR7轴，抑制或破坏ciRS-7抑制结直肠癌的进展。未来对ciRS-7降解的治疗方法的研究有望进一步增强肿瘤抑制功能。

4 小结与展望

在过去的几年中，人们对环状RNA的生物合成和分子功能的研究有了很大的进展。但是仍然还有许多未解之谜。目前几个独立的证据支持在结直肠癌发生发展中，环状RNA可以作为微小RNA的分子海绵发挥作用。未来关于靶基因、微小RNA和环状RNA之间的相互作用，环状RNA在调节结直肠癌增殖、侵袭、转移中的作用机制和作为分子标志物和基因治疗的原理和可行性，需要更系统和深入地研究和分析。确定参与结直肠癌肿瘤发生的众多功能性的环状RNA，探索它们的功能复合体和目标位点，以加强与环状RNA相关的结肠直肠癌的诊断和治疗方案。伴随着研究的深入以及环状RNA研究技术的发展，环状RNA有望成为结直肠癌早期诊断的分子标志物和基因治疗的新途径。