一株B 型副鸡嗜血杆菌的分离与鉴定

刘龙英

（山东省博兴县畜牧兽医局山东滨州256500）

副鸡嗜血杆菌是鸡传染性鼻炎的致病菌，该菌感染鸡后可引起急性或亚急性上呼吸道传染病，临床上该病菌潜伏期短、传播速度快、发病率高，且常与其它致病微生物一起引发混合感染，造成严重的经济损失。自2018 年6 月份以来，山东滨州博兴某养鸡场陆续发生蛋鸡产蛋迅速降低、打喷嚏、鼻孔流出黏液性或脓性分泌物等症状，严重者出现颜面肿胀、生长停滞等临床表现，每天发病鸡不断增多，但死亡鸡6～10 只/d 不等；通过到鸡场现场调研、采样、实验室分离鉴定等，最终确诊鸡群感染副鸡嗜血杆菌，并指导该鸡场采用有效药物开展治疗及加强免疫等，疫情得到了有效控制。现将实验室分离鉴定等工作总结如下。

1 病料采集

从发病鸡场将病死鸡取头或直接制备眶下窦棉拭子后，冷藏送至实验室进行分离研究。

2 细菌分离培养

将病死的鸡头病料消毒处理后，在无菌条件下，剪开眶下窦，用经火焰灭菌并冷却的接种环取眶下窦内液体或将眶下窦棉拭子分别接种于马丁肉汤营养琼脂培养基和含5%鸡血清及氧化型辅酶（NAD）的副鸡嗜血杆菌固体培养基上进行细菌分离培养，37℃微需氧条件下培养24～48h。结果马丁肉汤营养琼脂培养基没有细菌生长，而在含血副鸡嗜血杆菌固体培养基表面可见不溶血的边缘整齐、透明、轻微凸起、针状、细小的菌落，与副鸡嗜血杆菌相似。

3 染色镜检

挑取典型的疑似副鸡嗜血杆菌涂片后，进行革兰氏染色，镜检可见该分离菌株为两极浓染、无芽胞、无荚膜、无鞭毛的革兰氏阴性小杆菌，与副鸡嗜血杆菌相似。

4 PCR 法鉴定与分型

分别应用已经合成的副鸡嗜血杆菌鉴定引物和分型引物进行PCR 鉴定，鉴定引物上游序列为5'-GATGGCACAATTACATTTACA-3'，下游序列为5'-ACCTTGAGTGCTAGATGCTGTAGGTGC-3'，扩增目的条带大小为1600bp；A、B、C 型副鸡嗜血杆菌共用上游序列为5'-GCTCACAGCTTTATGCAACGAA-3'，A 型下游序列为5'-CGCGGGATTGTTGATTTTGTT-3'，扩增目的条带大小为800bp；B 型 下 游 序 列 为5'-GGTGAATTTCACCACACCAC-3'，扩增目的条带为1100bp；C 型下游序列为5'-TAATTTTCTTATTCCCAGCATCAATACCAT-3'，扩增目的条带大小为1600bp；首先将疑似副鸡嗜血杆菌菌落取单菌落加到100μL 灭菌水中，煮沸约10min 后离心取上清当做模板，鉴定PCR 反应体系为：上下游引物各1μL、模板1μL、PCR mix 12.5μL，补灭菌水至25μL，同时设立阴性对照；分型PCR 反应体系为上游引物和ABC 三型下游引物各1μL、模板1μL、PCR mix 12.5μL，补灭菌水至25μL，同时设立阳性对照；反应条件分别为98℃预变性1min，98℃变性10s，鉴定退火温度为55℃、10s，分型退火温度为56℃、10s，，72℃延伸2min，共30 循环，最后72℃延伸10min。反应结束后用1%的琼脂糖凝胶板电泳，电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析，结果与预期相符。

5 动物回归试验

将分离菌进行纯化后，稀释至50 万/0.2mL，通过窦内途径接种易感鸡，接种后48h 内全部发病。

6 药敏试验

将分离菌纯化后，进行常规药物的药敏试验，将强力霉素、庆大霉素、阿莫西林、环丙沙星、阿奇霉素、大观霉素、头孢噻呋钠、新霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠共9 种药敏片均匀贴在接种分离菌的平板上，37℃微需氧条件下培养24～48h。结果该分离菌株除对大观霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠呈中度敏感外，其余7 种均不敏感耐药。

7 小结

通过结合临床症状及实验室一系列的检验等实际情况，可确诊该发病鸡群感染了B 型副鸡嗜血杆菌。参考此次药敏试验的结果，建议该鸡场采用大观霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠联合用药进行治疗，治疗后疫情有效控制，病鸡好转，成年蛋鸡产蛋率逐渐恢复正常，无新发病例和死亡病例出现。随后对整个鸡群进行了疫苗强化免疫。研究发现副鸡嗜血杆菌可分为A、B、C 三种血清型，且各型之间没有交叉保护，此次疫情分析其原因是由于本地区一直流行由A 型副鸡嗜血杆菌引发的鼻炎，因此该场定期免疫鸡传染性鼻炎（A 型）灭活疫苗，而该疫苗对其他型鼻炎没有交叉保护的能力，当流行株发生改变时，不能发挥保护能力进而造成鸡群发病的情况。

副鸡嗜血杆菌极易感染育成鸡和蛋鸡而发病，且传染性极强，能够迅速蔓延至整个鸡群，因此一旦发病将给养鸡业造成一定的经济损失，所造成的经济损失大小与养殖场饲养管理水平高低及有无继发感染等众多因素密切相关。当前疫苗免疫是防治副鸡嗜血杆菌感染的根本措施，适时接种合适的疫苗能够有效的预防鸡传染性鼻炎病的发生，目前鸡传染性鼻炎（A 型）灭活疫苗应用较为广泛，但鉴于A 型和C 型鸡传染性鼻炎流行趋势日益突出，临床上也多选用鸡传染性鼻炎（A 型+C 型）、新城疫二联灭活疫苗进行全面预防，无论是种鸡还是蛋鸡每年需免疫两次疫苗。鉴于近年来B 型副鸡嗜血杆菌分离株不断出现，故在日常预防时应加强A、B、C 三型同时免疫，真正发挥疫苗的保护作用。除严格防疫外，副鸡嗜血杆菌感染的发生常与应激、饲养管理等诱因密切相关，因此养殖场应注重加强日常饲养管理。保持环境的卫生清洁和舍内良好的卫生条件，定期消毒，保证鸡舍适宜的温度，平时要加强舍内通风换气，保证供给优质全价的饲料，季节交替等关键时期更应加强饲养管理，增强鸡群抵抗疾病的能力。从根源杜绝病原菌的侵入，外购引进雏鸡或种鸡时必须严格检疫。同时养鸡场应结合本场或本区疫病的实际情况有计划的开展预防性投药。一旦发病疑似病例应尽早治疗，抗生素类药物和磺胺类药物仍是治疗鸡传染性鼻炎的重要手段，但应避免长期使用一种或错用滥用抗生素等，防止耐药性的产生。█