动物库布病毒研究进展

周秀蓉，肖霜艳，2，康桦华，陈小文，吕殿红，温肖会，翟颀，贾春玲，翟少伦*，魏文康*

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站 广州 510640；2.华中农业大学动物医学院 武汉 430000；3.四会市畜牧兽医局 广东肇庆 526200）

目前，研究库布病毒大部分是基于病原特征以及基因组特征来进行分子生物学技术以及血清学等方面的研究。本文旨在通过对库布病毒的研究进展进行阐述，希望对广大研究者有所帮助。

1 病毒的发现

库布病毒的首次发现可追溯到1989年，日本科研人员在日本爱知县的急性胃肠炎病人粪便样本中发现库布病毒，因在爱知县被发现，又名爱知病毒（Aichivirus）[1]。2003 年，Yamashita 等[2]在实验室体外培养HeLa 细胞的过程中，库布病毒被当成一种细胞因子被发现，通过检测和分析发现，库布病毒粒子来源于培养细胞用的胎牛血清，因此被命名为牛库布病毒。2007 年，在匈牙利和中国的腹泻仔猪粪便中检测到了猪库布病毒[3]。2010 年，在匈牙利家养绵羊粪便中，检测到了羊库布病毒阳性[4]。自从2007 年首次在中国腹泻仔猪粪便中分离出库布病毒，国内对该病毒的研究越来越多，逐渐发现库布病毒在我国广泛流行分布。

库布病毒被认为是国内的新发病原，初期研究发现其在腹泻动物粪便样本中可以被检测出来，因此推测其与动物的腹泻关系密切；随着对库布病毒的研究，对其的认识愈加全面。Reuter 等[5]发现，库布病毒可在野猪粪便样本中检测到。Jin 等[6]在健康动物粪便及血清中也检测到了库布病毒。综上，从多个研究结果中可推测库布病毒不仅作用于肠道细胞，可能还能穿过血管壁到达血液中，由此可见，库布病毒的致病机制较为复杂。此外，通过国内外的研究表明，库布病毒不仅感染动物，还感染人。通过对库布病毒的基因组序列的研究与分析可知，不同地区、不同物种、不同个体的库布病毒毒株的基因组序列存在着很大的差异。综合国内外所面对的动物卫生安全环境，基于库布病毒的变异性较大，因此在疫苗研制方面没有较大的实际意义。

2 病毒的分类

自1989 年发现库布病毒以来，科研人员逐步在猪牛羊等动物中检测到库布病毒。随着对库布病毒研究的增多，发现库布病毒除了人、牛、猪三种宿主以外，还感染犬、猫、鼠、绵羊等动物[4,7,8]。因此，在国际病毒分类委员会公布的第十次病毒分类报告中将库布病毒进行了分类，根据病毒所感染的宿主不同，以及基因同源性，分为Achivirus A、B、C、D、E、F 六类[9,10]。

牛、羊库布病毒（Bovine/Ovine kobuvirus BKoV/OKoV）根据对其基因组序列和遗传进化分析，将二者归纳于B 型爱知病毒。2003 年，在日本一实验室中发现了第一株牛的库布病毒，其被命名为U-1 毒株（GenBank 登录号，AB084788.1）[2]。U-1 毒株全长基因组为8374nt。U-1 毒株是在实验室培养细胞的过程中被当作一种细胞诱变剂而发现的。通过对其基因组和病毒粒子特性分析，将其归纳于B 型爱知病毒，这种“细胞诱变剂”来源于用于培养细胞的胎牛血清。另有研究发现从黑牛体内分离得到一株库布病毒不属于B 型爱知病毒，而被归类于D型爱知病毒。由此可见相同物种中感染的库布病毒可能不属于同一种病毒类型[11]。2018 年，Fakry F 等[12]首次报告了埃及牛群中的BKoV 感染情况，其中埃及BKoV 毒株（GenBank 登录号，KY407744.1）基因组长度为8319nt，与U-1 毒株在核酸和氨基酸水平上同源性分别为89.5%和96.3%；与绵羊库布病毒[A]（Gen-Bank 登录号，GU245693.2）在核酸和氨基酸水平上同源性分别为81.5%和86.2%。2011 年，从韩国黑山羊的粪便中，检测到了库布病毒（GenBank 登录号，JF714211.1）[13]。将该病毒进行全基因组测序以及进行基因序列的同源性比对和遗传进化分析，发现羊库布病毒与牛库布病毒具有较高的同源性，因此将羊库布病毒也归类于B 型爱知病毒。

猪库布病毒（Porcine kobuvirous，PKoV）是C 型爱知病毒的唯一成员，该病毒与牛羊源库布病毒基因序列及结构有较大的差异。2008 年，在匈牙利的猪群粪便样品中检测到库布病毒，通过对该毒株（Kobuvirus/swine/S-1-HUN/2007/Hungary）（GenBank登录号，EU787450.2）基因组进行分析，将该病毒暂时归类于C 型爱知病毒[3]。该毒株基因组大小约为8.2kb。Zhai 等[14]研究发现一株新型的PKoV，与S-1-HUN 株对比，其在2B 区域缺失了30 个氨基酸。

在近期的研究中发现，从同一宿主中可以分离出多株不同库布病毒毒株。此外，从带毒猪/牛中可能分离得到基因组与BKoV/PKoV 基因组相似度更高的毒株。

3 病毒基因组特征

库布病毒（Kobuvirus，KBV）是微小RNA 病毒科库布病毒属成员，无囊膜的单股正链RNA 病毒，直径约为30nm，病毒粒子为球形的二十面体对称结构，表面有很多凸起[15]。基因组大小为8.2～8.3kb。库布病毒基因组中GC 的含量高达59%。其3'UTR 端非常长，最长可达240bp，5'端复杂的二级结构涉及RNA 复制和衣壳化[16]。

库布病毒全基因组具有小RNA 基因组特征，全基因组被分为两部分，包括非编码区和编码区。非编码区包括5'端的UTR 区和3'端的UTR 区；5'端有一个编码VPg 小分子蛋白的区域，该蛋白主要充当引物参与RNA 的复制；3' 端有一个较长的富含A 的ployA 尾[15]。编码区有一个较大的开放阅读框ORF，近5'端有一个前导蛋白L 的编码区，以及编码一个多聚蛋白；多聚蛋白可以裂解为三个结构蛋白和七个非结构蛋白。将该区域分为P1、P2、P3 三个区域，P1 编码结构蛋白包括VP0、VP3、VP1，参与病毒衣壳蛋白的合成；P2、P3 编码2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 七种非结构蛋白[16,17,18]。其VP1 蛋白具有良好的免疫源性，VP1 基因突变率较高，常发生同源重组[19]。3D 序列为库布病毒的保守序列，因此常针对3D序列设计引物，检测库布病毒。

4 流行病学

牛库布病毒（Bovine Kobuvirus，BKoV）最早被发现于胎牛血清中，通过血清学方法在72 份牛血清中检测出42 份为库布病毒阳性（59.2%）[2]。后来，在国内外相继有在牛粪便中检测到库布病毒的报道。在对泰国、韩国、比利时、匈牙利、荷兰、意大利和巴西等多个国家的流行情况研究发现，BKoV 的总流行率在1%～40%之间。2008—2010 年，韩国患腹泻牛群中的BKoV 检测率为34.6%～36.1%（37/107～13/36），而犊牛（66.7%）中的BKoV 检出率明显高于青年牛（25.0%）和奶牛（18.4%）[20,21]。意大利腹泻牛粪便样品中BKoV 的检出率为4.9%（7/142）[22]。巴西BKoV 检出率14.4%（31/216），并发现幼仔感染率最高，随年龄增长呈下降趋势；1 个月的犊牛为82.6%（19/23），年龄较大的犊牛为38.5%（5/13）[23]。埃及BKoV 检出率为66.7%（24/36）[24]。中国检出率为1%～34.9%，其中，Chang 等[25]收集了来自中国四个主要奶牛产区中腹泻牛的166 个粪便标本，通过RT-PCR 检测BKoV，BKoV 阳性率为34.9%（58/166）。师志海等[26]在建立牛嵴病毒与牛诺如病毒双重PCR 检测方法中，检测了127 份腹泻牛粪便样品，BKoV 检出率为4.72%（6/127）。此外，最近在匈牙利的家养绵羊和韩国的黑山羊中也发现了类似BKoV[4,27]，这表明B 型爱知病毒在反刍动物包括牛、羊群体中具有世界性的分布。

猪库布病毒最早在匈牙利被发现，在随后的报道中表明，在美国、匈牙利、意大利、捷克、荷兰、巴西、中国、韩国、日本和泰国等国的猪群中广泛分布着PKoV。PKoV 在腹泻和健康猪中均能被检测出，该病毒的阳性率从3.9%～100%不等。据报道，在匈牙利野猪中发现了高流行的PKoV（100%），这一发现表明，野猪也可能是PKoV 的重要宿主[5]。Chu 等[28]通过RT-PCR 方法检测了在2009—2013 年期间在泰国北部仔猪群收集的636 个粪便样品，腹泻仔猪中和无症状仔猪中检测出库布病毒阳性率分别为95.6%（505/528）和96.3%（104/108），由此可知，泰国北部仔猪普遍感染PKoV。2010 年，Wang 等[29]对上海三个猪场收集的116 例粪便样本进行了筛查，发现PKoV 感染率为38.8%（45/116）。Chen 和Wang 等[19,30]对中国四川省、甘肃省PKoV 的流行现状进行调查发现，PKoV 的检出率分别为53%（87/163）和62.1%（126/203），其中腹泻样品中猪库布病毒总检出率为64.3%，无症状猪的PKoV的感染率为29.4%（15/51）。张沙等[31]利用RT-PCR 方法对2011、2012 年期间来自中国27 个省市126 个猪场的病料共计448 份进行了3D 基因的检测，PKoV 阳性率为25.0%，猪场阳性率为40.48%（51/126）。Mai 等[32]在对猪博卡病毒进行流行病学调查过程中发现PKoV 的感染率高达68.7%。2017 年，Zhai 等[14]调查国内某猪场对库布病毒的感染率，发现竟高达90%，且伴随着中度博卡病毒1 型感染。王玮等[33]对山东省2014—2016 年冬采集的350份病料样品进行RT-PCR 检测，结果显示，在350 份病料样品中，PKoV 阳性率为56%（196/350），阳性猪场占80%（24/30）；非腹泻猪个体阳性率（65.38%，153/234）明显高于腹泻猪个体阳性率（37.07%，43/116）；育肥猪的PKoV 阳性率（97.50%）远高于哺乳期仔猪（45.40%）、断奶期仔猪（52.75%）以及成年猪（66.67%）；夏秋季节采集的样品PKoV 检出率（71.94%）明显高于冬春季节（45.50%）。统计PKoV 与PEDV、TGEV 混合感染结果显示，虽然PKoV 在非腹泻猪群中单独感染率（61.11%，143/234）远高于腹泻猪群(18.97%，22/116)，但非腹泻猪群PKV 与PEDV 和TGEV 的混合感染率却明显低于腹泻猪群。刘占旭等[34]在建立RAP 快速诊断PKoV 方法的过程中，对2016—2017 年采自河南、新疆、黑龙江等地的276 份临床猪腹泻样品进行检测，PKoV 的检出率为58.7%。杨振等[35]对江苏省七个县域猪嵴病毒感染的流行病学调查结果表明所有样品猪嵴病毒感染阳性率达52.73%（116/220），阳性猪场占79.41%（27/34）。由以上研究表明，PKoV 在国内的流行范围较为广泛，且感染率较高，不仅感染家猪还感染野猪，且不同年龄阶段猪群的感染率不一致。同时PKoV 的感染呈现出典型的季节特性，但无区域特性。无症状猪与腹泻猪均可检测到PKoV，且常伴随着多种病毒混合感染。

5 病毒与疾病的相关性

Yang 等[36]通过建立健康仔猪模型，然后对该模型仔猪进行单一变量的攻毒试验；作用一段时间后，将不同的组织器官进行病理学研究，结果表明库布病毒可引起肺、胃、小肠等器官不同程度的细胞脱落、淋巴细胞聚集等炎症反应。由此可见，库布病毒在机体的定植范围较为广泛。此外，大多数携带有猪库布病毒、牛库布病毒与羊库布病毒的动物可能表现为腹泻、消瘦、恶心等临床症状；有部分携带者并不表现出任何的临床症状。因此KBV 是否致病目前尚没有直接的证据证明，但是PKoV 在猪群中感染率很高，不仅感染患病猪群，健康猪粪便中也可以检测到猪库布病毒，由此可以推测库布病毒在动物体内的长期存在能致使宿主患病。另有研究表明，动物感染库布病毒的同时，亦会感染其他病毒，例如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪星形病毒、猪轮状病毒和猪博卡病毒等[37,38,39]，可推测库布病毒可能与其他病毒共同作用于动物机体，从而对动物机体造成不同程度的损伤。

6 病毒的培养与检测

6.1 病毒的培养

在2003 年的一项研究中表明，牛库布病毒可以使HeLa 细胞产生细胞病变（CPE），但是无法从该细胞中分离得到病毒[2]。目前对PKV 易感细胞系的研究表明，PKV 无法导致HeLa 细胞、Vero细胞、PK-15 细胞、MDBK 细胞、Mac-145 细胞、ST 细胞、RD 细胞等细胞系产生CPE。但是PKV 在Vero 细胞系盲传6 代或者11代后，无法检测到猪库布病毒[40]，由此推测可能检测到的是接种的病毒核酸，而PKV 可能不在Vero 细胞中复制。在目前对猪库布病毒的研究中还未找到PKV 的易感细胞系。

6.2 病毒的检测

6.2.1 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶链式反应检测方法常用于病原的遗传进化分析以及各种动物疫病的检测，该检测是以分子生物学为基础，建立起来的一种简便、快速的方法。该方法敏感性、特异性和重复性较好。库布病毒属于RNA 病毒，因此检测该病毒需要使用反转录聚合酶链式反应（Revers Transpersiton PCR，RT-PCR）。2007 年匈牙利科学家就是通过RT-PCR 方法检测猪库布病毒。随着库布病毒全基因组序列被公开，大多数研究者基于库布病毒的3D 序列设计三种病毒的通用检测引物，可以用于检测不同动物源库布病毒。孟丽等[41]根据多种腹泻病毒基因组建立了多重PCR 法，该研究中PKV 阳性率最高，为26.98%（2015 年）和45.79%（2016 年）。胡军勇等[42]建立了多重RT-PCR 法检测多种腹泻病毒，其敏感度为180fg/mL、特异性良好，不会和其他病毒模板发生非特异扩增。

6.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Polymerase Chain Reaction）随着科学技术的进步与发展，实时荧光定量PCR 逐渐被应用于临床检测。Real-time PCR 的敏感性、特异性以及重复性都要优于普通PCR，且其检测限较低，这样可以更加准确地检测和判断动物机体是否感染库布病毒。同时，Real-time PCR操作简单方便，可以实时监控扩增过程中基因拷贝数的变化，与普通PCR 比较，省略了凝胶电泳的步骤，可以减少大量时间。Real-time PCR 检测方法不仅能够进行定性检测还能进行定量检测，其产物同样也可以进行胶回收等试验。刘孟良等[43]建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR 法，其扩增效率可达到91.8%，检测出的最低拷贝数为100 拷贝。谢荣辉等[44]建立的猪库布病毒Taq Man 荧光定量RT-PCR 检测方法能特异性检测猪库布病毒，与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应，对标准质粒检测灵敏度达10 copies/μL；模板终浓度在107～10copies/μL 范围内时，与标准曲线Ct 值有良好的线性关系；Real-time RT-PCR 阳性检出率（30.94%）高于普通RT-PCR（29.50%）。

6.2.3 重组酶聚合酶扩增（RPA）快速诊断方法 刘占旭等[34]建立了RPA 快速诊断方法，结果表明该方法对KBoV 最低检测限度为3.36×102copies/μL 的质粒DNA，该方法具有良好的敏感性。对208 份临床猪粪便样品进行了检测，结果显示，猪库布病毒阳性率为73.1%，明显高于常规RT-PCR 的46.6%，两种方法的符合率为90.2%。

6.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）朱庆贺等[45]基于猪库布病毒重组VP3 蛋白建立了间接ELISA 检测方法，检测55 份临床血清样品，其中28 份样品为PKV 抗体阳性，而RT-PCR 检测结果显示有32 份样品呈阳性，这两种方法的符合率为90.3%。VP1 蛋白具有良好的免疫原性，田野[46]基于VP1 蛋白建立了间接ELISA 检测方法，结果显示我国华北地区PKV 感染率高达81.25%。

7 展望

自2008 年在我国猪粪便中检测到库布病毒以来，对库布病毒的研究逐渐增多。在 2010—2018 年期间，研究热度较高。但由于库布病毒基因组在物种之间的差异性较大，且易发生变异，对该病毒的研究难度变大。由于还未找到猪库布病毒的易感细胞系，导致在对病毒的分离上遇到了较大的阻碍。目前对库布病毒的研究仍集中在对该病毒基因组的遗传进化分析、检测方法以及流行病学上的研究。虽然对该病毒的致病机制、感染性克隆、稳定的体外培养系统等方面的研究不少，但突破性进展仍然很少。相信通过科研人员今后更加深入的研究，将逐步揭开库布病毒的神秘面纱，从而获得更多库布病毒的科学知识。