SPE和QuEChERS净化测定番茄中链格孢霉毒素方法比较

周贻兵，兰优，李磊，吴玉田，郭华

（贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004）

番茄是重要的蔬菜作物之一，在其种植、储藏过程中易受多种病原真菌的危害，特别是易受链格孢霉属真菌的侵害[1]，可产生70 多种有毒代谢产物，统称为链格孢霉毒素[2-3]，其中主要有链格孢酚（alternariol，AOH）、交链格孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、腾毒素（tentoxin，TEN）以及细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）。链格孢霉毒素具有细胞毒性[4]、基因毒性以及急性毒性[5]，会对人体健康产生危害。因此，为了解番茄中链格孢霉毒素的污染状况，本试验对番茄中链格孢霉毒素进行检测，这对控制番茄及其制品的质量安全，维护人类健康具有重要的意义。

目前，我国尚未颁布食品中链格孢霉毒素的限量和检测方法标准，相关文献报道的链格孢霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法[6]、液相色谱法[7]，液相色谱-质谱联用[8-10]等方法。液相色谱质谱法因具有定性准确、灵敏度高等特点已成为检测链格孢霉毒素的主流方法，但番茄中含有较高的色素等组分，不同样品前处理方法对链格孢霉毒素测定结果具有较大影响，本文比较了固相萃取（solid-phase extraction，SPE）和QuEChERS 两种不同净化手段对回收率的影响，对准确测定番茄中链格孢霉毒素含量具有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

U3000 超高效液相色谱、TSQ Quantum Ultra 三重四极杆串联质谱仪：Thermo Fisher 公司；3-18K 台式高速冷冻离心机：Sigma 公司；Milli-Q 超纯水机：Millipore；MS3 涡旋混均仪：德国 IKA；KQ55-DE 型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 标准品及耗材

1 mg/瓶 AOH、AME、TeA，0.5 mg/瓶 TEN 标准品：普瑞邦生物科技有限公司。将链格孢霉毒素标准品配制成浓度为100 μg/mL 的标准储备液，-20 ℃冰箱保存，备用。

甲醇、乙腈（色谱纯）、PEP 固相萃取柱（200 mg/6cc）：美国Thermo 公司；甲酸：纯度99 %，阿拉丁试剂（上海）有限公司；碳酸氢铵、氯化钠、无水硫酸镁、磷酸二氢钠：优级纯，上海国药集团化学试剂有限公司；C18吸附剂：粒径40 μm，上海安普实验科技股份有限公司；实验用水为一级水；24 份番茄样品：贵阳市的超市或农贸市场。

1.3 样品前处理

SPE 净化法[11]：称取5.0 g 匀浆的番茄样品于50 mL聚丙烯刻度离心管中，加入25 mL 乙腈-甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（pH=3.0）（体积比 45 ∶10 ∶45）涡旋混匀，超声提取 30 min，10 000 r/min 离心 5 min，转移上清液，用水定容至30 mL，混匀。准确移取6.0 mL 提取液，加入 15 mL 0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液（pH=3.0），混匀，PEP 柱净化，用5 mL 甲醇和5 mL 乙腈洗脱，抽干柱子，合并洗脱液，45 ℃水浴氮吹近干，用2 mL 乙腈-1 mmol/L 碳酸氢铵水溶液（体积比 50 ∶50）溶解，涡旋混匀30 s，10 000 r/min 离心5 min，取上清液在优化的色谱质谱条件下进样分析。

QuEChERS 净化法[12]：称取 5.0 g 匀浆的番茄样品于50 mL 聚丙烯刻度离心管中，加入10 mL 0.4%甲酸-乙腈，涡旋混匀，超声提取30 min，加入0.5 g 氯化钠、5 g 无水硫酸镁，涡旋1 min，10 000 r/min 离心5 min，取 1.5 mL 上层提取液于 QuEChERS（25 mg C18）净化管中，涡旋1 min，取0.5 mL 净化液于2 mL 塑料离心管中，加入0.5 mL 1 mmol/L 碳酸氢铵水溶液，摇匀，10 000 r/min 离心5 min，取上清液在优化的色谱质谱条件下进样分析。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 超高效液相色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm），柱箱温度：35 ℃，流动相：1 mmol/L 碳酸氢铵溶液-甲醇；流速：0.2 mL/min，进样体积：10 μL。线性梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源正负离子切换扫描，，ESI+喷雾电压：3 800 V，ESI-喷雾电压：3 200 V，离子源温度：320 ℃，脱溶剂温度：300 ℃，鞘气（N2）压力：276 kPa，辅助气（N2）压力：104 kPa，碰撞气（Ar）压力：0.2 Pa，多反应监测（multi-reactions monitoring ，MRM）参数见表2。

表2 质谱参数Table 2 The parameters of mass spectrum

2 结果与讨论

2.1 质谱及色谱条件的优化

分别采用ESI+和ESI-模式下对目标物进行全扫描，找出响应较大的准分子离子，改变碰撞能量，进行二级质谱扫描，找出2 个信号较强且稳定性好的子离子构成监测离子对，结果见表2。

TeA、AME、AOH 在ESI-离子模式下响应值较高，而ALT 和TEN 在ESI+响应较高，所以本试验采用正负切换扫描模式测定5 种链格孢霉毒素。考察甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01%氨水水溶液、甲醇-20 mmol/L醋酸铵、甲醇-1 mmol/L 碳酸氢铵不同流动相条件下5 种链格孢霉毒素的分离情况。使用甲醇-0.01%氨水水溶液为流动相，TeA 形态的改变，在C18色谱柱上无保留，在死时间位置出峰，当使用甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时，TEA 以分子态形式存在，出峰推迟，峰形拖尾；使用甲醇-20 mmol/L 醋酸铵时，除了TEN 外，其余4 种链格孢霉毒素的响应值下降；为了使各组分达到基线的完全分离，峰形较好，本文选择了甲醇-1 mmol/L 碳酸氢铵为流动相，正负切换扫描模式测定4 种链格孢霉毒素，获得良好的效果，MRM 图谱见图1。

图1 种链格孢霉毒素的MRM 图谱Fig.1 MRM chromatograms for four kinds of alternaria toxins

2.2 提取液的比较

TeA 是一种酸，用酸化提取液有利于提高其提取效率[9]，在SPE 净化方法时，选择磷酸二氢钠溶液（pH=3.0）-甲醇-乙腈溶液提取，而在QuEChERS 方法中由于磷酸二氢钠是非挥发性盐，会结晶堵塞喷针和离子传输管等，因此常选择挥发性的酸，所以本文选择了甲酸酸化的乙腈作为提取液，本试验将含（0.1 %、0.2 %、0.4%、0.8%、1.6%）甲酸-乙腈溶液为作为提取剂，分别对样品进行提取，结果表明：在乙腈中加入0.1%～0.4%的甲酸时，TEA 的回收率升高显著，回收率大于70%，其余4 种链格孢霉毒素的回收率变化不明显，但甲酸含量过高，基质中过多的酸性物质进入乙腈层，竞争电离，产生抑制效应，回收率反而下降，综合考虑，选择0.4%甲酸-乙腈作为提取液，获得良好的提取效果。

2.3 净化方法的选择

番茄样品提取液中含有色素、糖等共萃组分需采取一定的净化方法去除干扰，提高链格孢霉毒素定量结果的准确性。QuEChERS 方法使用的净化剂种类繁多，不同的净化剂去除干扰物质的效果各不相同，比较了常使用净化剂有C18、N-丙基乙二胺（N-propylethane-1，2-diamine，PSA）、石墨化炭黑（graphitizable carbon，GCB）的净化效果。GCB 主要用于去除样品提取液中的色素，但对平面结构的物质有吸附作用，当使用GCB 作为净化剂时，AOH、AME 几乎没有回收；PSA 主要用于吸附样品中的有机酸等弱酸性成分和糖类，采用 PSA 净化，TeA 和 AOH 的回收率随着 PSA 的用量增加而降低，ALT、TEN、AME 变化不显著；C18对去除脂类和蛋白质有较好的效果，TEA 未净化前，有较强的基质抑制效应，采用25 mg 的C18净化后，能有效的消除基质效应，5 种链格孢霉毒素的回收率在80 %～115 %之间，满足回收率要求，综合考虑，选择25 mg C18作为净化剂。

2.4 标准曲线、检出限与定量限

根据番茄中链格孢霉毒素含量水平，将4 种链格孢霉毒素用乙腈-1 mmol/L 碳酸氢铵水溶液（体积比50 ∶50） 稀 释 成 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100、160 ng/mL 标准系列，在优化的仪器工作条件下进行分析，以待测目标物的质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，以S/N=3 计算方法的检出限，以S/N=10 计算方法的定量，结果见表3。

4 种链格孢霉毒素在2.5 ng/mL～160 ng/mL 浓度范围内，线性关系良好，相关系数（r2）大于0.994 3，相比而言，由于使用SPE 净化时，稀释倍数低，检出限和定量限相对于QuEChERS 法要灵敏。

表3 番茄酱中4 种链格孢霉毒素的线性方程、相关系数（r2）、检出限及定量限Table 3 Regression equations，correlation coefficients（r2），detection limits（LOD）and quantification limits（LOQ）of the four alternaria toxins in tomato

2.5 方法的准确度和精密度

在 5.0 g 番茄空白样品中加入 10、200、360 μg/kg标准溶液，折算最终仪器的测定浓度，分别位于标准曲线的彽、中、高，每个添加浓度水平测定6 份平行样，方法的加标回收率及精密度相对标准偏差结果见表4。

番茄样品提取液中含有色素、糖等共萃组分需采取一定的净化方法去除干扰，提高链格孢霉毒素定量结果的准确性。将传统的SPE 法与QuEChERS 方法进行了比较，从表4 可以看出，SPE 的回收率在21 %～69 %，相对标准偏差值为1.3%～7.3%，交链孢酚单甲醚回收率最高，约69%，交链孢酚回收率最低，低、中、高平均回收率22.7%，净化过程中损失严重，而采用QuEChERS 方法的平均回收率在81%～115%，精密度相对标准偏差在2.1 %～11.2 %，回收率远高于SPE法，且QuEChERS 方法与SPE 净化法操作简便快速。

表4 方法的加标回收率及精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precisions for the method（n=6）

2.6 样品的检测

应用QuCHERS 方法对24 份不同霉变程度的番茄样品中4 种链格孢霉毒素含量进行了测定，TeA、AOH、AME含量分别在 16.4 μg/kg～132.6 μg/kg、6.13 μg/kg～23.8 μg/kg、6.26 μg/kg～14.6 μg/kg 之间；有 1 份样品检出TEN，含量为4.21 μg/kg，且霉变部分的链格孢霉毒素远高于未霉变部分的含量，但未霉变部分仍受到链格孢霉毒素的污染，所以当番茄霉变后，去除霉变部分食用仍有一定程度的潜在风险，图2 为阳性样品的TIC 图谱。

图2 阳性样品的TIC 图谱Fig.2 TIC chromatograms of positive samples

3 结论

本文将不同净化方法SPE 和QuEChERS 测定番茄中链格孢霉毒素方法进行了比较，采用SPE 法的理论检出限、定量相对于QuEChERS 方法更灵敏，但SPE 固相萃取净化的回收率在21 %～69 %，远低于QuEChERS 方法的平均回收率在 81 %～115 %，且QuEChERS 方法操作简便，避免固相萃取柱活化、上样、洗脱、氮吹等步骤，简便快捷，避免SPE 过柱过程中堵柱，更适用于番茄中链格孢霉毒素含量的测定。