益生菌发酵苹果汁过程中总酚酸变化与动力学研究

高振鹏 宋 杨 张美娜 韩梦珍 岳田利

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院， 陕西杨凌 712100；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(杨凌)， 陕西杨凌 712100)

0 引言

苹果富含多酚，苹果多酚以游离态及结合态的形式存在，具有抗氧化及预防心血管疾病等作用[1-2]。酚酸(对羟基苯甲酸或对羟基肉桂酸衍生物)是多酚的一种，在植物中主要以共价键的形式存在。使结合态多酚(包括酚酸)转变为游离态多酚以产生更大的功效，是目前的研究方向。另外，苹果加工产品急需升级，功能化加工是未来果蔬加工的发展方向之一。益生菌具有调节人体肠道菌群平衡及抗肿瘤等[3-7]多重功能。通过益生菌发酵苹果汁，既使苹果汁含有益生菌，又可使苹果汁中结合态多酚变为游离态多酚，增加了苹果汁中功能成分含量。

苹果汁营养物质丰富，是益生菌发酵的良好载体。目前，大部分研究围绕苹果汁发酵工艺、菌种筛选及发酵前后风味变化展开[8-10]，对发酵过程中功能物质的变化研究较少。动力学模型能够对微生物发酵过程进行准确预测[11-13]，有助于优化发酵工艺，对于扩大工业化生产具有重要意义。微生物的种类繁多，发酵物质变化复杂。目前，尚未见混菌发酵使苹果汁中结合态酚酸变为游离态酚酸的动力学及其模型构建方面的研究报道。

本文以复合苹果汁为原料，利用植物乳杆菌、发酵乳杆菌及嗜酸乳杆菌协同发酵，对苹果汁发酵过程中总酚酸及单体物质含量进行动态分析，探究其变化趋势，构建混菌发酵苹果汁中菌体生长及总酚酸变化动力学模型，旨在为开发功能苹果汁产品及其产业化提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜酸乳杆菌6005(Lactobacillusacidophilus)、植物乳杆菌21805(Lactobacillusplants)、发酵乳杆菌21828(Lactobacillusfermentum)，均保存于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室；阿克苏苹果、秦冠苹果、澳洲青苹果，均购于陕西省杨凌区当地市场；MRS培养基(乳酸细菌培养基)，北京奥博星生物技术有限责任公司；儿茶素(色谱纯)，上海源叶生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)， 美国TEDIA公司；没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、对羟基苯甲酸(纯度98%以上)，上海源叶生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GP2000-2型榨汁机，南通金橙机械有限公司；HSQ-1型恒温水浴锅，上海智城分析仪器有限公司；ZX-35B1型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BCN-1306B型超净工作台，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；ZXSD-A1160型恒温培养箱，上海智城分析仪器有限公司；HC-3018R型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；LC-15C型高效液相色谱仪，日本岛津公司；UV-1700型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；RE-5205型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1苹果汁制备

制备工艺为：苹果挑选→清洗→切块→榨汁→酶解(45℃，2 h)→抽滤→复配(阿克苏苹果、秦冠苹果与澳洲青苹果体积比为4∶3∶1)→-18℃冷冻待用。

1.3.2苹果汁发酵

将保存于甘油管中的3株菌分别置于MRS液体培养基中活化培养2次，当第2次扩大培养液体培养基中菌体浓度达到9.0 lg CFU/mL时备用。将活化好的发酵剂(菌体浓度9.0 lg CFU/mL)在8 000 r/min的转速下离心10 min，弃上清液，用灭菌后的复合苹果汁重新悬浮[14]。将重悬后的益生菌按照嗜酸乳杆菌6005、植物乳杆菌21805与发酵乳杆菌21828的体积比1∶1∶1，以3%的接种量接入复合苹果汁中，36℃下静置发酵24 h，期间定时取样。

1.3.3活菌数及理化指标测定

活菌数采用倾注平板计数法(GB 4789.35—2016)测定；可滴定酸含量采用酸碱滴定法(GB/T 15038—2006)测定；总糖含量采用斐林试剂滴定法(GB/T 15038—2006)测定。总黄酮含量采用氯化铝法测定[15]：以儿茶素质量浓度(mg/L)为横坐标，510 nm处的吸光度为纵坐标，得到的标准曲线方程为y=0.034 4x-0.003 6，R2=0.999 9；总酚酸含量采用FeCl3-K3[Fe(CN)6]比色法测定[16]：以没食子酸质量浓度(mg/L)为横坐标，720 nm处的吸光度为纵坐标，得到的标准曲线方程为y=0.491 9x+0.004 4，R2=0.994 8。

1.3.4多酚单体含量测定

多酚单体含量测定采用高效液相色谱法[17]，略有修改。

样品处理：取20 mL发酵苹果汁，并用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，每次用20 mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，用1 mol/L盐酸溶液调节剩余发酵苹果汁的pH值至2.0，再每次用20 mL乙酸乙酯萃取3次。合并萃取得到的酚提取液，35℃下旋转蒸发至干燥，用10 mL甲醇溶解干物质，经0.22 μm有机系滤膜过滤备用。

色谱条件：采用Agilent 5 TC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为2%乙酸水溶液，流动相B为含0.5%乙酸的乙睛-水溶液(体积比1∶1)；梯度洗脱程序：流动相B的体积分数在0～50 min，由10%增到55%，在50～60 min，由55%增到100%，在60～65 min，递减到10%，在此体积分数下平衡10 min；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。检测器：紫外吸收检测器；检测波长：对羟基苯甲酸、扁蓄苷为254 nm，肉桂酸为260 nm，没食子酸、原花青素B2、原花青素C1、表儿茶素、根皮苷、根皮素为280 nm，绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、芦丁为360 nm。

1.4 动力学研究

通过优化得到发酵条件为接种量1.8%，发酵温度37℃，在此条件下进行动力学研究，每隔1 h测定菌体生物量及总酚酸含量，建立菌体生长及总酚酸变化模型并验证，预测发酵过程变化。

1.4.1菌体生物量测定

将发酵苹果清汁稀释后于600 nm波长下测定吸光度。菌体光密度(OD值)为OD读数与稀释倍数的乘积。

1.4.2菌体生长动力学模型

Logistic方程是用来描述发酵过程中菌体生长量随时间变化规律最常用的模型，是典型的“S”形曲线。研究发现，混合菌株发酵苹果汁符合这一规律，因此采用Logistic方程[18]对发酵过程进行研究。

1.4.3总酚酸变化动力学模型

总酚酸变化与菌体生长变化趋势相似，将苹果汁发酵过程中总酚酸与菌体OD值进行线性制图，二者呈线性关系，说明总酚酸含量的增加与菌体生长相关联。通过Logistic、Sgompertz和Boltzmann方程[19]分别建立总酚酸变化动力学模型，通过比较模型相关系数确定最终总酚酸变化模型[20-21]。

1.5 数据处理

试验重复3次，利用Microsoft Office Excel 2016软件对数据进行计算；利用SPSS 20.0软件进行方差显著性分析；利用Origin 2018软件绘图及模型拟合验证。

2 结果与讨论

2.1 活菌数、总糖及可滴定酸含量

对益生菌发酵苹果汁发酵过程中的活菌数、总糖及可滴定酸含量进行动态监测，绘制曲线，结果如图1所示。

图1 发酵过程中活菌数、总糖及可滴定酸含量的变化曲线Fig.1 Changes of viable count, total sugar and titratable acid during fermentation process

由图1可知，4 h后苹果汁中益生菌进入对数生长期，生长繁殖速度明显加快，活菌数迅速增加。此后，随着发酵的进行，营养物质消耗，代谢产物不断积累，益生菌的繁殖速度逐渐下降。16 h后益生菌繁殖进入稳定期，24 h发酵结束时，活菌数基本保持稳定，即活菌菌体浓度为2.68×108CFU/mL。益生菌维持自身生长和繁殖都需要糖代谢供能，发酵初始苹果汁中总糖质量浓度为12.74 g/(100 mL)，可滴定酸质量浓度为2.97 g/L。接种后，益生菌利用苹果汁中的可发酵糖，将其转化为酸。随着益生菌发酵苹果汁发酵过程的进行，苹果汁中总糖含量呈下降趋势，可滴定酸含量呈上升趋势。发酵结束时，总糖质量浓度下降至10.25 g/(100 mL)，可滴定酸质量浓度增加到5.04 g/L。

2.2 总黄酮及总酚酸含量

对益生菌发酵苹果汁发酵过程中的总黄酮及总酚酸含量进行动态监测，结果如图2所示。

由图2可知，益生菌发酵苹果汁初期，苹果汁中总黄酮质量浓度为218.73 mg/L，16 h时达到220.54 mg/L，随后开始下降，24 h时降为210.49 mg/L。发酵过程中苹果汁中总酚酸含量总体呈上升趋势，初始发酵时，总酚酸质量浓度为142.96 mg/L，随后不断上升，16 h时达到204.06 mg/L，发酵后期总酚酸含量基本趋于稳定。多酚是一大类物质，根据酚环数量和彼此结合的结构分为酚酸、类黄酮、芪和木质素[22]。由于酚酸在植物中主要以共价键的形式存在，发酵过程引起苹果汁中酚酸类物质含量变化的原因很多，部分原因是微生物分解共价键结合的大分子酚酸物质为小分子酚酸物质，使其含量升高，也可能是由于膳食结合态酚酸能被微生物利用转化为游离态酚酸所致[23-24]。

2.3 酚酸类单体含量

在苹果汁发酵过程中，对苹果汁中7种酚酸类单体含量进行动态分析，结果如表1所示。

表1 发酵过程中酚酸类多酚单体质量浓度的变化Tab.1 Changes of phenolic polyphenols content during fermentation process mg/L

由表1可知，7种酚酸类单体成分中，绿原酸含量最高，初始发酵时质量浓度为89.10 mg/L，随着发酵的进行，其含量不断变化，20 h时达到最大值，质量浓度为112.53 mg/L，随后稍有下降，24 h时绿原酸质量浓度为106.69 mg/L，比初始发酵时增加了19.74%，发酵之后绿原酸含量显著升高(p<0.05)。初始发酵时没食子酸质量浓度为0.74 mg/L，12 h时质量浓度达到1.84 mg/L，24 h发酵结束时没食子酸质量浓度为1.73 mg/L，是初始发酵时的2.34倍，发酵前后含量差异显著(p<0.05)，主要是聚合单宁水解可以生成没食子酸[25]。另外，在发酵过程中对羟基苯甲酸含量及阿魏酸含量变化差异不显著，其中阿魏酸是微生物合成多种香气成分的前体物质[26]。咖啡酸、对香豆酸及肉桂醛的含量总体呈现下降趋势，发酵前后含量变化差异显著(p<0.05)。

2.4 益生菌发酵苹果汁动力学研究

2.4.1菌体生长及总酚酸含量变化动力学曲线

在益生菌发酵苹果汁过程中，随发酵的进行，菌体OD值及总酚酸含量也在发生变化，结果如图3所示。

图3 发酵苹果汁动力学曲线Fig.3 Kinetics curves of fermented apple juice

由图3可知，3 h后苹果汁中益生菌繁殖进入对数生长期，菌体生长迅速，大量繁殖，17 h后菌体生长速度减缓，菌体数量趋于平稳，进入稳定期。总酚酸含量变化趋势与菌体生长曲线趋势基本一致。

2.4.2菌体生长动力学模型的建立

Logistic方程[18]为

(1)

式中x——菌体的OD值

t——发酵时间,h

μm——比生长速率的最大值，h-1

xm——发酵过程菌体的最大OD值，其不随基质浓度变化而改变

当t=0时，x=x0(菌体的初始OD值)为初始条件，式(1)积分变形为

(2)

菌体的最大OD值xm=1.318，根据不同时间菌体量的试验数据，用Origin软件进行非线性拟合，经过运算得到x0=0.319 7，μm=0.247 1 h-1。

将x0、xm、μm代入式(2)得到菌体生长动力学模型为

(3)

2.4.3总酚酸变化动力学模型的建立

为了研究益生菌发酵过程中总酚酸变化动力学过程，利用Logistic、Sgompertz和Boltzmann模型[19]对试验数据进行拟合，确定最佳的总酚酸变化动力学模型方程，各模型拟合方程及其决定系数见表2，P表示总酚酸增加量。

表2 总酚酸增加量拟合方程及其决定系数Tab.2 Fitting equations and its determination coefficients for total phenolic acid increment

由表2可知，对比益生菌发酵过程总酚酸变化动力学方程Logistic、Sgompertz和Boltzmann建立的3个拟合方程的决定系数，相关性均较高，其中，Boltzmann模型拟合效果最好，其决定系数R2为0.991 5，说明Boltzmann模型能够更好地描述益生菌发酵过程总酚酸变化，因此，本研究选取Boltzmann模型方程为益生菌发酵过程总酚酸变化动力学最佳模型。

2.4.4模型验证

为了检验建立的菌体生长动力学模型和总酚酸变化动力学模型的可靠性，对动力学模型的理论值与试验数据实测值进行比较，结果如图4、5所示，对模型进行方差分析，结果如表3所示。

图4 菌体生长模型拟合曲线Fig.4 Fitting curve of microbial growth kinetics model

图5 总酚酸增加量变化模型拟合曲线Fig.5 Fitting curve of total phenolic acid increment model

由图4、5可知，菌体生长模型和总酚酸变化模型方程计算理论值(拟合值)与试验数据实测值符合较好，可以用上述两个方程作为菌体生长及总酚酸增加量变化的模型。由表3可知，菌体生

表3 发酵动力学模型方差分析Tab.3 ANOVA for fermentation kinetic model

长模型和总酚酸增加量变化模型的决定系数分别为0.993 9和0.991 5，模型拟合程度很高，说明模型能够很好地预测益生菌发酵苹果汁过程中菌体生长和总酚酸变化过程。

为进一步验证模型可靠性，对益生菌发酵苹果汁过程中的发酵试验值和模型理论值进行比较，结果如表4所示。

由表4可知，菌体生长模型理论值和试验值的平均误差为2.64%，总酚酸增加量变化模型理论值和试验值的平均误差为5.97%，均小于10%，说明模型拟合度高，能够很好地描述发酵过程的变化规律。

3 结论

(1)利用嗜酸乳杆菌6005、植物乳杆菌21805和发酵乳杆菌21828混菌发酵由阿克苏苹果、秦冠苹果和澳洲青苹果3个品种复合的苹果汁，发酵过程中活菌菌体浓度达到2.68×108CFU/mL，总糖含量下降，可滴定酸含量上升，总酚酸含量总体呈上升趋势，16 h时总酚酸含量达到最大值，各多酚单体中绿原酸及没食子酸等功能性酚酸类多酚单体含量增加。

表4 动力学模型试验值与理论值的比较Tab.4 Comparison of experimental and calculated data of kinetic model

(2)对益生菌发酵苹果汁进行动力学研究，建立了菌体生长动力学模型和总酚酸含量变化动力学模型并加以验证，决定系数分别为0.993 9和0.991 5，试验值与理论值的平均误差均小于10%，说明建立的模型可以很好地描述发酵过程，预测发酵中酚酸的变化过程。