纤维素生物质厌氧消化的生物预处理研究进展

徐琬莹，田建茹，左 华，邵 蕊，李伟娜

(1.青岛市环境保护科学研究院，山东 青岛 266003；2.青岛市环境保护科学研究设计有限公司，山东 青岛 266005)

纤维素生物质组成以纤维素、半纤维素为主，其次是木质素、蛋白质、氨基酸等[1]。木质素具有非水溶性和化学结构复杂性，难被酸和酶水解，且木质素与半纤维素以共价键形式结合，形成一种天然屏障[2]，导致纤维素生物质能源化利用效率不高。预处理技术包括物理、化学、生物法以及多种方法联合。传统物理和化学法耗能较大，成本较高，例如，高温热解预处理，温度需达300℃[3]；此外，化学法需要加入化学药品，如碱预处理[3]，增加了环境污染的风险性。生物法具有节约资源、节约能源和减轻环境污染等方面的优点[1]，近年来得到较快发展和重视。生物法利用提取酶或微生物，破坏纤维素生物质结构，提高厌氧消化产沼气量。完全水解木质素为多数为真菌类，最常见是白腐菌、褐腐菌和软腐菌[4-5]；细菌以高温放线菌为主，包括链霉菌、节杆菌属、小单孢菌属等，此外，假单胞菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等细菌对木质素有一定水解能力[6]，并具有较强纤维素水解能力。

目前研究进展主要是所有预处理方法(物理、化学、生物、联合法)对于纤维素生物质厌氧消化产甲烷的影响[7-8]，单独生物预处理比较研究较少，且不全面。本文聚焦生物预处理，综述了提取酶、单一微生物、菌群对厌氧消化产甲烷的影响，为纤维素生物质厌氧消化的高效性、环境友好性研究和应用提供参考。

1 纤维素生物质组成、水解酶及生物预处理

1.1 组成及相关水解酶

纤维素生物质组成包括木质素、纤维素、半纤维素、蛋白质、果胶、氨基酸等，其中纤维素、半纤维素、木质素为主要有机成分[1]，3种有机物质占纤维素生物质约40%以上，而对于秸秆类和树木类，这3种成分比例更高，为60%以上[9-15]。纤维素生物质的水解需要由多种酶共同作用，主要分为木质素酶、纤维素酶和半纤维素酶3大类[16]。由于木质素和半纤维素的结构具有复杂性和多变性的特点，所以水解酶种类较多，分别为7和10种；而纤维素酶仅有3种，详见图1；除上述3类水解酶外，淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶也影响纤维素生物质的水解过程[17]。

图1 纤维素生物质相关水解酶[16,18-20]

1.2 生物预处理

生物预处理指厌氧消化前利用微生物或提取的酶，提高底物水解的一种预处理方法[2]。这种方法将厌氧消化的水解阶段分离出来[21]，利用微生物或提取的酶，去除木质素和打破交织结构。然而，对于碳水化合物，预处理过程和厌氧消化过程会存在竞争[22]，如果预处理过程水解过多会导致甲烷产量减少，因为纤维素和半纤维素发生损失[23]，所以，不需完全去除木质素，当大量葡萄糖在酶作用下释放，木质素和纤维素之间链接裂解，即可开始厌氧消化[24]，影响因子主要有：预处理时间、预处理温度、氧气浓度和微生物种类等。

2 酶预处理对厌氧消化产甲烷的影响

2.1 木质素酶

锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Laccase)和复合过氧化物酶(VP)预处理纤维素生物质均能提高厌氧消化产甲烷量，且可以减少酚抑制[25-26]，其中漆酶效果最佳，漆酶预处理玉米秸秆24 h后，提高24.19%产甲烷量；而锰过氧化物酶加复合过氧化物酶的预处理时间则是6 h效果最佳，提高甲烷产量17.49%[26]，这不仅说明了不同木质素酶的预处理效果有差异性，也反映了最佳预处理时间不同。此外，在相同木质素酶的条件下，不同纤维素生物质也有差异[25]，24 h酶预处理后，芒草、玉米秸秆、亚麻和柳木产甲烷量分别为141.7，223.6，244.1和97.2 Nl·kg-1VS，比对照组高出4.4%，8%，13.59%和32.07%；而小麦秸秆和大麻最高甲烷产量为6 h预处理组，但相对于对照组甲烷产量无提高[25]，因为漆酶有一定负面效应，产生的苯氧自由基阻拦了纤维素酶和小麦纤维素接触[27]。小球藻细胞壁主要成分为纤维素，利用商业漆酶预处理小球藻，可以提高20%甲烷产量[28]。此外，也有学者提出单一酶预处理对厌氧消化产甲烷无效果[29]，而漆酶与化学联合预处理，则比单一化学预处理效果好，其中漆酶联合碱预处理能提高38%甲烷产量[29]。总体上，木质素酶预处理纤维素生物质产甲烷的效果取决于底物种类、木质素酶种类和预处理时间。

2.2 纤维素酶和半纤维素酶

单一纤维素酶预处理纤维素生物质，可提高厌氧消化的甲烷产生量，Wang[30]利用纤维素酶系预处理玉米秸秆，包括：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，提高了103.2%的甲烷产量；但纤维素酶和半纤维素酶联合预处理更能快速提高水解率，如β-木糖苷酶和β-葡糖苷酶[31]，研究得出，内切葡聚糖酶和木聚糖酶混合预处理甜菜渣，比单一内切葡聚糖酶的产气效果好[32]，因为综合提高了纤维素和半纤维素水解。Rodríguez[33]使用了内切葡聚糖酶、附属纤维素酶、木聚糖酶和阿魏酸脂酶预处理玉米芯和葡萄树枝，均提高了两种底物厌氧消化的甲烷产生量，其中葡萄树枝底物甲烷提高率比玉米芯高，达59.8%，因为阿魏酸脂酶有去木质化作用，对于木质素组分高的葡萄树枝底物，水解效果更好。此外，酶预处理可与物理、化学预处理进行结合，例如：碱、碱+挤压和超声波预处理[33-35]，这些研究得出，联合预处理产甲烷量比单一酶预处理高，说明了物理法、化学法扩大纤维素酶和半纤维素酶与底物的接触面积。然而也有其它研究表明，在预处理过程中添加纤维素酶和半纤维素酶，无法增加甲烷产量[36-37]，因为接种物中微生物分泌的纤维素和半纤维素酶足够水解底物，且添加酶和不添加酶的处理间微生物种群无差异性[37]。

2.3 其它酶

商品淀粉酶和蛋白酶也能促进纤维素生物质厌氧消化产甲烷，α-淀粉酶预处理玉米秸秆比单一纤维素酶更能提高甲烷产量，提高了110.79%，因为玉米秸秆中也包含淀粉，在淀粉酶作用下，生成大量葡萄糖和低聚物[30]；但是蛋白酶预处理效果不如淀粉酶和纤维素酶，仅提高了1.47%[30]。对于细胞壁由纤维素构成的藻类，蛋白酶预处理可提高其甲烷产量，如：蛋白酶预处理小球藻，可以增加2.6倍的甲烷产量，77%有机氮得到矿化[38]，因为藻类主要成分是蛋白质。因此，其它酶预处理效果，取决于纤维素生物质其它组分含量及结构。

总体上，酶预处理虽然有专一性、温和性和高效性等优点[39]，但对于厌氧消化产甲烷来说，效果不明显，且酶提取成本颇高[21-22]；此外，由于酶有自身生长优化条件范围，不易适应外界环境[40]。酶的提取通常来源于植物、动物和微生物，最主要的来源为微生物[41]。预处理过程中添加微生物，提供了一个持续产酶的可能性[42]，且酶多样性高、成本低[43]，有效促进厌氧消化产甲烷。

3 单一微生物预处理对厌氧消化产甲烷的影响

3.1 真菌

真菌不仅能产生木质素酶[44]，而且还能高效生产β-葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶[45]；此外，真菌的产酶效率和酶多样性较高，用真菌进行预处理成本较为低廉[43]。真菌预处理纤维素生物质提高厌氧消化产甲烷的研究较多，早在1983年，Bisaria利用Pleurotussajor-caju处理稻秆40天后，木质素、纤维素、半纤维素比例都发生下降，其中木质素水解程度最高，从17%下降到9%，而处理后稻秆厌氧消化15天的产气量提高了53.8%[46]。Pleurotussp.“florida”预处理小麦秸秆也能水解木质素[47]，预处理30天木质素仅水解了0.9%，甲烷产量提高了10%，而60天和90天后的木质素水解程度相当，木质素比例分别下降了2.5%和2%，甲烷产量分别提高了18%和28%，研究表明预处理时间越长，甲烷产量越高[47-48]；但预处理时间越长，半纤维素也发生了损失，预处理90天后，半纤维素损失了6.2%[47]，因此最佳预处理时间为60天。

白腐真菌比棕腐真菌具有更强的木质素水解能力，Ghosh[49]研究得出：Phanerochaetechrysosporium和Polyporusostreiformis预处理稻秆后，产甲烷量分别提高了46.19%和31.94%。在白腐真菌中，不是木质素去除能力越强，甲烷产量越高，Capelar[50]研究了72种白腐真菌发现，木质素去除能力最强的是Lentinuscrinitus，60天木质素水解了80%，而提高甲烷产量最多为Peniopharautriculosa，表明了在预处理过程中，纤维素和半纤维素产生损失。因此，木质素去除和碳损失之间的平衡是生物预处理研究关注重点之一，Agosin[51]采用14C-lignin追踪方法，不同温度条件下，探索8种白腐真菌处理小麦秸秆的碳损失，研究得出仅有Dichomitussqualens和Cyathusstercoreus在15～20天具有较强木质素去除能力，且碳损失最少；这两种真菌在30℃～35℃范围内的酶活最佳。虽然Sporotrichumpulverulentum和StrainNancon在短时间内水解木质素达40%以上，但导致了较多碳损失。

除了稻秆、小麦秸秆、玉米秸秆、桔子皮等农业废弃物，真菌对于木质素含量较高的纤维素生物质促甲烷产生效果更好，例如：日本香柏木、日本柳杉芯和剑麻叶[52-54]。Amirta[52]研究得出3种Ceriporiopsissubvermispora预处理日本香柏木的产甲烷效果比Pleurocybellaporrigens好，所有真菌预处理日本香柏木，8周比4周产生更多甲烷，其中C.subvermisporaATCC90467最高，甲烷产量提高率达350%。此外，接种量对甲烷产量也有影响，里氏木霉处理剑麻叶，不同接种量提高甲烷产量范围为30%～101%；但并不是接种量越高，甲烷产生量越多，最佳接种量为10%[54]。近15年真菌预处理的研究比较见表1。

由表1可见，菌种、预处理时间、温度等因子影响厌氧消化产甲烷效果。具有木质素去除能力的真菌集中在多孔菌属、栓菌属、木霉菌属、香菇属、火菇属、平革菌属、隔孢伏革属、黑蛋巢菌属、革盖菌属、拟蜡菌属，其中效果最好为拟蜡菌属和平革菌属，沼气或甲烷提高率均能达到100%以上[52,57-59]，但仅限于木质素含量较高的农林废弃物，对于草类效果不明显[63]，而且木质素含量越高[67]，沼气或甲烷提高率越大。预处理时间通常为5～90天[55-68]，在一定范围内，预处理时间越长，沼气或甲烷产量越高，但时间过长(>60 d)则会引起纤维素和半纤维素的损失，沼气或甲烷产量反而降低[65]。最佳预处理温度为60%～75%[60,64-65]，最佳接种量为10%[54,62]，而预处理最适合温度范围为25℃～30℃。

表1 近15年真菌预处理纤维素生物质产甲烷研究比较[55-68]

总体上，真菌预处理纤维素生物质虽然能高效去除木质素(20%～80%)，且无抑制厌氧消化过程的代谢物质产生，沼气或甲烷提高率为10%～300%；但也存在3个缺点[43,69]：一是预处理时间长，一般1周至3个月；二是容易导致纤维素和半纤维素的损失；三是需要特定固态生长介质，生长条件要求高，定植困难。

3.2 细菌

细菌具有体积小、繁殖速度快、适应性强等特点[70]，比真菌更易培养。水解木质素的细菌大多为好氧或兼性细菌，主要集中在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等[71]，例如：变形菌门中的Pseudomonasputida和Enterobactersolisp[72-74]；放线菌门的RhodococcusjostiiRHA1.[72,75-76]；厚壁菌门下BacillusligniniphilusL1和Bacillussp.BP-7[77- 78]。具有木质素水解能力细菌见表2，其中变形菌门的细菌为革兰氏阴性细菌，而放线菌门和厚壁菌门的细菌为革兰氏阳性细菌。此外，一些研究发现变形菌门中，Sphingobiumsp.SYK-6也具木质素水解能力[73,79]。

单一细菌预处理对厌氧消化影响的研究较少，He[80]37℃利用Bacilluslicheniformis预处理Chlorellavulgaris，60 h后进行厌氧消化，甲烷产量提高9.2%～22.7%，且接种量越高，甲烷产量提高率就越大。温度对细菌预处理产甲烷有影响，55℃高温更利于Pseudobutyrivibrioxylanivorans水解微藻生物质，Vidmar[81]使用Pseudobutyrivibrioxylanivorans预处理微藻，经过24 h甲烷提高率为6%(37℃)和17%(55℃)，此外，细菌和微氧结合能缩短预处理时间和预处理温度，Bacilluslicheniformis预处理过程中通以不同氧气量，得出5 mL·g-1VS处理甲烷提高率能达17.6%[82]，和之前研究相比[80]，将预处理时间缩短到24 h；在5 mL·g-1VS通氧量和37℃条件下，Bacillussubtilis预处理玉米秸秆后，甲烷产量提高率达17.35%[83]，降低了预处理温度。

表2 具有木质素水解能力细菌[6]

总体上，相对于真菌，细菌木质素水解能力比较弱[45]，细菌漆酶和过氧化物酶目前所存在酶产量低、酶活性低、容易失活等问题[70]，所以，厌氧消化生物预处理关注单一细菌较少，研究集中在细菌群落预处理。

4 菌群预处理对厌氧消化产甲烷的影响

4.1 贮存预处理

青贮和黄贮可作为一种生物预处理方法应用于厌氧消化中，一类是直接贮存，利用自身的菌群；另一类是人工添加特定微生物或菌群(青贮剂)。直接贮存常见于早期的研究中[84]，近年来，主要关注人工添加微生物对贮存及厌氧消化的影响。青贮剂SILASIL ENERGY(Lactobacillusplantarum和Lactobacillusbuchneri)、BONSILAGE PLUS(L.plantarum,Pediococcuspentosaceus和L.buchneri)，BIO-SIL(L.plantarum)的添加，促进玉米和黑麦产甲烷，其中BONSILAGE PLUS作用90 d后，相对于空白对照组，甲烷提高率分别为12.6%和10.2%；但相对于自然贮存90 d 的处理，仅有3%差异性[85]。青贮剂Silasil Energy(乳杆菌、戊糖乳杆菌和布赫内氏乳杆菌)，Sil-all(L.plantarum,Enterococcusfaecium,Pediococcusacidilacti,Lactobacillussalivarius和4种酶)、Microferm(乳酸菌、酵母菌和真菌，未知种类)能有效提高玉米厌氧消化产气量，分别为11.8%，10.1%和14.7%[86]，此外，Kristensen[87]研究发现，青贮剂Sill-All Fireguard(同质消化乳酸菌，纤维素酶、淀粉酶、苯甲酸钠、钾)和BiotalAxcool Gold(异质和同质消化乳酸菌、木聚糖酶、Beta-葡聚糖酶)的添加，分别将干物质损失从3.5%～6.5%降低到2.3%～5.0%和3.6%～5.6%。对于高羊茅和羊茅黑麦草，最高甲烷产量都是Sill-All Fireguard添加处理，高羊茅最佳贮存时间是3个月，而羊茅黑麦草最佳贮存时间是6个月；对于芦，青贮剂的添加并不能提高其厌氧消化甲烷产量。因此，贮存预处理影响厌氧消化产甲烷过程，其关键因子有：青贮剂组成、贮存时间、底物种类。

4.2 堆肥预处理

堆肥可作为一种由天然或未受控复杂菌群作用下的生物预处理，但极少应用到厌氧消化中[43]。尽管在好氧条件下，有机质容易消耗，物质和甲烷会损失，但可避免厌氧消化体系酸化[88]。纤维素生物质堆肥预处理的研究颇少，Zhou[89]研究得出，玉米秸秆和牛粪于室温下堆肥20 d后，厌氧消化产气量提高了30%。在60℃～70℃高温下开展堆肥预处理稻秆7 d，每个堆肥预处理厌氧消化的产气率都提高了，预处理后木质素从31.95%下降到27.60%，总碳损失仅1.4%[90]。但是，将堆肥后好氧菌群直接用于生物纤维预处理(20 d)，厌氧消化的沼气和甲烷产量并未提高[29]。

4.3 微氧预处理

通氧可作为厌氧消化的一种预处理方法以提高生物质的水解。Nguyen[91]在研究城市固体废弃物处理时，以0.4 L·kg-1h-1的空气流量进行曝气预处理，经过五天的曝气后，不仅沼气产量大幅提高，而且提高了沼气中甲烷所占比例。不同于水解阶段曝气，Fu SF[92]在预处理时采用了更少通氧量和通氧时间，提高玉米秸秆厌氧消化产气和产甲烷量，得到最佳通氧量是5 mL·g-1VS，产甲烷量提高了16.24%，这是因为微氧预处理前后菌群发生了变化，厚壁菌门下Clostridia增多，预处理后Clostridiales相对丰度77.99%，高于处理前15.7%(见图2和图3)，产生多种水解酶促进生物质水解[93-94]。因此，微氧预处理(Micro-aerobic pretreatment)也作为生物预处理方法之一，可应用于厌氧消化中。

图2 微氧预处理前菌群结构[93-94]

图3 微氧预处理后菌群结构[93-94]

4.4 人工菌群预处理

由于细菌繁殖快和共生能力强，近年人工菌群研究聚焦在特定细菌群落筛选和功能强化。不同于真菌，细菌群落通常有较高的纤维素、半纤维素水解能力[22]。无锡水稻土和高温填埋场筛选的高温菌群，55℃预处理木薯渣，其中12 h 预处理甲烷产量最高，提高率为96.63%[95]；通过测序得出，微生物主要为梭菌属、芽孢杆菌属细菌及未识别土壤土著菌。此外，用来源于土壤腐植质的菌群处理玉米秸秆15 d，甲烷产量提高75.57%，包括酵母菌、一些可水解纤维素细菌和乳酸菌[96]。

复合菌剂MC-1是从不同底物堆肥后筛选的菌群[97]，具有很强的纤维素和半纤维素水解能力[98-99]，主要包括了5种功能菌株ClostridiumstraminisolvensCSK1,Clostridiumsp.strainFG4,Pseudoxanthomonassp.strainM1-3,Brevibacillussp.,strainM1-5,Bordetellasp.strainM1-6[100]。Yuan[101]使用MC-1预处理玉米秸秆，厌氧消化甲烷产量最高的处理是6 d,2%接种量，提高率达140%。MC-1还应用于预处理废纸，预处理时间4 d 最佳，最佳接种量2%，厌氧消化甲烷提高率24%～42%[102,103]。Cuo[104]也从堆肥体中筛选菌群，然后加入土壤土著菌，形成的复合菌剂XDC-2；菌群主要包括[105]：Alcaligenes sp.(98%),Alcaligenesfaecalis,Beta proteobacterium,Pseudomonadales bacterium等。与MC-1不同，XDC-2具有较强的半纤维素水解能力，高效产生胞外木聚糖酶，6 d 达330～490 U·Ml-1，稻秆12 d半纤维素水解了78.27%，而纤维素只损失14.08%[105]。Yuan[106]将XDC-2复合菌剂应用于玉米秸秆厌氧消化，预处理5 d后，甲烷提高率达87.9%。此外，Wen[107]比较了MC-1，XDC-2和WSD-5处理狼尾草后厌氧消化效果，3和7 d预处理，MC-1和XDC-2甲烷提高率比WSD-5高，7 d预处理后的厌氧消化甲烷提高率分别为137%和124%；而WSDS-5预处理13,17和21 d效果最佳，因为WSD-5复合菌剂(凋落物和土壤中筛选)包含细菌和真菌，而真菌需要较长预处理时间，才能有效地去除木质素[108-109]。

BYND-5包括Firmicutes(5.96%),Bacteroidetes(40.0%),Deferribacteres(8.94%),Proteobacteria(16.17%),Lentisphaerae(2.13%),Fibrobacteraceae(1.7%)和uncultured bacterium (25.1%)；LMC复合菌群从甘蔗蔗渣堆肥体中筛选，包括Clostridium,Rhodocyclaceae,bacilli和uncultured bacteria，无真菌存在，具有较强纤维素和半纤维素水解能力，而半纤维素酶活性比纤维素酶活性高[110]。BYND-5和LMC分别预处理稻秆和牛粪纤维素，提高了稻秆厌氧消化10%～20%的甲烷产量[111]。根据不同接种量，牛粪纤维素厌氧消化甲烷提高率为14%～59%，但接种量并不是越高越好，其中3∶1接种量最佳，提高率达59%[112]。此外，Muoz[113]从海洋中筛选复合菌群，包括Aeromonas,Pseudomonas,Chryseobacterium和Raoultella，预处理微藻后，甲烷产量提高了140%～158%。Poszytek[114]从污泥和沼液中分离了100多个具有纤维素水解能力的菌株，组成的MCHCA菌群能有效水解玉米秸秆，产气量提高了38%。

5 结论与展望

部分微生物预处理效果明显优于化学和物理预处理，且无污染。提取酶预处理有专一性、温和性和高效性等优点，但也有效果不明显、成本高的缺点。单一微生物预处理，真菌效果优于细菌，木质素去除率20%～80%，沼气或甲烷提高率为10%～300%，但存在时间长、碳损失、定植困难的缺点。单一细菌木质素水解能力较弱，相关研究较少，甲烷提高率10%～20%，所以研究集中在细菌群落，其中人工细菌群落预处理效果最佳，沼气或甲烷提高率达10%～200%。

然而，单一微生物比菌群更容易控制，所以特定功能菌的产酶基因表达有待进一步研究，使其在特定条件下高效生产木质素酶；同时，运用代谢组学方法，进一步研究环境因子诱导调节其代谢途径，提高预处理过程木质素和半纤维素水解率。此外，对于菌群预处理，不同种类微生物之间相互协同作用也需进一步探索，将特殊高效菌进行组合，加快推动生物预处理菌剂在沼气工程中的应用。