乐山市金口河区板厂坪蜜环菌的分离及系统发育分析

陈克保 林宜锦 欧梦莹

摘要    蜜环菌作为天麻重要共生菌，能为天麻的生长提供营养。了解区域性蜜环菌的多样性有助于选育优良的土著蜜环菌，进而提高区域性天麻的产量和质量。本文应用纯培养技术和基于ITS基因序列的系统发育分析，对金口河区板厂坪天麻种植区分离的21份蜜环菌进行了多样性研究。结果表明，21株蜜环菌划分为6个形态类群;系统发育分析显示分离菌株与Armillaria同源性最近，相似性都在99% 以上，主要分布在Armillaria gallica、Armillaria sinapina和Armillaria mellea 3个种内。

关键词    蜜环菌;分离;系统发育;四川乐山;金口河区

中图分类号    Q949.32        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）20-0049-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    As an important symbiotic bacterium of Gastrodia elata，Armillaria can provide nutrition for the growth of Gastrodia elata. Understanding the diversity of regional honey fungus will help to select excellent Armillaria，and thus increase the yield and quality of Gastrodia elata. In this paper，the pure culture technique and phylogenetic analysis based on ITS gene sequence were used to study the diversity of 21 Armillaria isolated from the Gastrodia elata planting area of Jinkouhe district Banchangping.The results showed that 21 strains of Armillaria were divided into 6 morphological groups. The phylogenetic analysis showed that the isolates had the closest homology with Armillaria，and the similarity was over 99%，mainly distributed in Armillaria gallica，Armillaria sinapina and Armillaria mellea.

Key words   Armillaria;isolation;phylogeny;Leshan Sichuan;Jinkouhe District

蜜环菌（Armillaria）隶属于真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目口蘑科蜜环菌属的一种药食两用真菌，在世界各地均有分布[1]。目前全世界已经鉴定的蜜环菌生物种有40多种，其中欧洲7个、北美洲10个、非洲5个、澳洲5个，亚洲至少19个，我国分布有15种[2]。该属真菌有些种可与天麻和猪苓共生为天麻和猪苓的生长提供营养，天麻共生蜜环菌生物种有Armillaria gallica、Lineage 1、CBS O、CBS L、Armillaria nabsnona、Nag. E 和Armillaria cepistipes，而猪苓共生蜜环菌的种类尚未明确[3]。蜜环菌属有些种还是严重的森林病原菌[4]，能侵染针叶树、阔叶树等600多种树木引起根腐病，造成经济损失[5]。此外，有些种则具有重要的食药用价值。东北名菜“小鸡炖蘑菇”中的蘑菇别称榛蘑就是蜜环菌中的一种[6]。蜜环菌还具有催眠、镇静、改善心脑、血液循环、降血糖、抗氧化、调节免疫和抑制肿瘤等药用价值[7]。

在过去的几十年里，基于形态特征（子实体大小、形状、孢子颜色等）和交配试验对蜜环菌物种的鉴定取得了很大的进展。然而，由于蜜环菌生物种类众多且形态特征相似，这些方法都非常有限[8]。近年来，分子生物学技术在蜜环菌生物种的鉴定方面得到了很好的应用[9]。在分子生物学技术中，采用单个的ITS、IGS、EF-1α序列鉴定方法，不能准确鉴定到每一个蜜环菌种[6]，而多序列结合RFLP 等技术的应用，使难以区分的近缘种或未知种的准确鉴定成为可能[1]。

金口河板厂坪天麻种植区地处四川盆地西南边缘，该区分布有大量的杉木、柳杉、核桃等喬木树种以及珙桐、水杉、银杏等珍贵树种。同时板厂坪天麻种植区海拔1 900 m，年均气温17 ℃，年日照时数1 130 h，年均降水量1 100 mm，平均湿度在80%左右，非常适合蜜环菌的生长[10]，而此地区蜜环菌的研究还未见相关报道。本研究尝试从金口河板厂坪天麻种植区采集样本，分离蜜环菌，应用可培养技术和基于ITS基因序列的系统发育分析该地区蜜环菌的多样性，以期为开发金口河蜜环菌资源及探索适合天麻生长的本地蜜环菌选育提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    菌株。蜜环菌菌材采自乐山市金口河区板厂坪天麻种植区，将采回后的菌材培养在外尺寸530 mm×370 mm×270 mm、内尺寸485 mm×330 mm×220 mm、装有2/3土壤、湿度70%～80%的周转箱中，同时立刻进行分离蜜环菌。

1.1.2    分离纯化培养基。①分离培养基：玉米麦麸培养基（玉米粉100 g，麦麸80 g，大豆10 g，白糖18 g，水1 000 mL）;纯化培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（新鲜土豆200 g，切成小块，加入蒸馏水1 000 mL，水煮沸时开始计时，30 min后，停止加热，用纱布过滤，补充滤液至1 000 mL，滤液中加入2%葡萄糖，滤液加热后，加入1.5～2.0%琼脂，培养基制作完成，并常规倒平板或斜面，待用）。

1.1.3    主要试剂和仪器。玉米粉、麦麸、大豆粉、白糖和新鲜土豆，购于超市;Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒，购于杭州博日科技有限公司;PCR试剂，购于生工生物工程（上海）股份有限公司;琼脂糖为BIOWEST AGAROSE;PCR扩增仪为EasyCycler;电泳仪为DYY-8C型，北京六一仪器厂;凝胶成像仪为BioDocAnalyze;本研究使用的真菌通用引物ITS4和ITS5由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2    试验方法

1.2.1    菌索分离、纯化。试验采用黄万兵等[11]和张玉方[12]相结合的分离方法对蜜环菌进行分离，即在超净工作台中用无菌水将蜜环菌菌索洗净，用75%酒精浸泡30 s，用无菌滤纸擦干菌索，用左右手的拇指和食指分别捏住菌索相距1 cm处，在酒精灯火焰旁缓慢用力向两边拉至断裂，断裂处会拉出长短不一的白色菌丝，用无菌剪刀剪取3～5 mm白色菌丝，接种于玉米麦麸培养基，置于26 ℃恒温培养箱中避光培养。培养6 d后将分离培养基中的菌索按以上操作接种于PDA培养基内，并在相同条件下培养，观察记录菌索形态特征。

1.2.2    DNA提取。蜜环菌菌索用无菌水冲洗，用无菌滤纸吸干菌索表面水分，-80 ℃冷冻备用;DNA提取采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒，提取步骤按说明书严格操作。

2    结果与分析

2.1    分离菌株的形态特征

从板厂坪天麻种植基地分离得到21株蜜环菌，采用黄万兵[15]对蜜环菌形态类群划分方法，将分离的21株蜜环菌划分为6个形态类群。G1类群菌株菌索开始生长时间相对较早，菌索直径较细，分支不明显，生长不弯曲;G4类群菌株菌索开始生长相对较晚，菌索直径较粗，分支明显，生长卷曲（表1）。

2.2    菌株DNA提取及系统发育分析

各类群菌株在培养6 d后菌索达到DNA提取用量，试验选取6个代表菌株进行DNA提取，真菌通用引物ITS4和ITS5扩增的DNA分子大小在850 bp左右，扩增结果和凝胶电泳检测结果一致（图1），PCR扩增得到了较高质量的总DNA，扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳可以检测到清晰明亮的PCR扩增条带。

根据测序结果，经SeqMan软件拼接序列后，6个菌株的ITS序列长度范围在853～870 bp之间，GC含量在43.84%～44.31%之间。将6个菌株的ITS序列在GenBank公共数据库中用Blast程序进行序列比对，分离菌株与Armillaria同源性最近，相似性比对都在99%以上。M1和Armillaria gallica的相似性为99.17%，M2、M5和Armillaria mellea的相似性均为99.64%，M3、M4和Armillaria sinapina的相似性为99.06%，M6和Armillaria mellea的相似性为99.30%（表2）。

本文对蜜环菌的ITS序列进行测定和系统发育分析，并构建了系统进化树（图2）。系统发育分析和序列比对结果一致，M1菌株和Armillaria gallica聚在一支，支持率为100%;M2、M5、M6亲缘关系较近，以87%的支持率占据一支，同时和Armillaria mellea以73%的支持率聚在一大支。

3    结论与讨论

本文基于ITS序列对金口河区板厂坪天麻种植区蜜环菌进行了分子鉴定，共鉴定出3种蜜环菌物种：Armillaria gallica、Armillaria sinapina和Armillaria mellea。与贵州天麻主产区和鄂西地区的蜜环菌生物种相比较，金口河區板厂坪天麻种植区蜜环菌物种多样性相对较低[6，11]，造成这种现象的原因可能是单个的ITS、IGS、EF-1α序列的鉴定方法不能准确对此地区部分蜜环菌进行鉴定[6]。门金鑫等[1]研究表明，用于蜜环菌生物种的鉴定还有限制性片段长度多态性技术（RFLP，restriction fragment length polymorphism）和随机扩增多态性 DNA 技术（RAPD，random amplified polym-orphic DNA）等，但这些技术也只能准确鉴定部分蜜环菌生物种。多序列结合RFLP 等技术更能较好地对金口河区板厂坪天麻种植区蜜环菌资源进行鉴定。

在本文鉴定出的蜜环菌生物种中，3种蜜环菌在欧洲、北美洲以及亚洲均有分布，却在澳洲和非洲未见分布[16-17]。通过比较发现造成这种差异性的原因可能是蜜环菌对不断变化的地理环境的适应，从而进化出不同的物种。此外，根据Coetzee MPA等[18]对中国蜜环菌的研究，这3种蜜环菌在中国均有分布，然而在不同省份[6，11]蜜环菌的分布情况也不同，说明不同蜜环菌对环境因子的适应性存在着差异。另一方面，对于气候和环境变化如何影响蜜环菌以及寄主和它们的共存却知之甚少，过去几年对病原体方面的研究并没有带来许多新见解。例如，预测气候变化对蜜环菌根腐病发病率的影响是具有挑战性的，因为生命周期的不同阶段，包括传播、感染和繁殖，可能会直接或间接的受到影响，并且影响可能完全不同。缺乏与蜜环菌相关树木死亡率的长期研究及其与人类活动引起的环境变化的多重复杂相互作用，限制了对不断变化的环境中蜜环菌的进化理解。