超高效液相色谱法同时测定洋常春藤中8种成分含量

倪力军，文丹瑶，胡甜甜，高丽丽，胡江宁，金汉台，金志文，张立国*

(1.华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2.中国医学科学院药物研究所，北京 100050；3.浙江康恩贝中药有限公司，浙江 丽水 323400)

洋常春藤(HederahelixL.)为五加科常春藤属常绿藤本植物，原产于欧洲，现于世界范围内广泛种植[1]。洋常春藤在欧美等地作为一种药用植物，已被广泛应用于咳嗽、哮喘和支气管炎等呼吸道疾病的治疗[2-4]，而在我国药用研究很少。洋常春藤中除了含有研究最多的三萜皂苷类物质[5-6]，还含有黄酮类、聚乙炔、有机酸类、花色苷类、香豆素类、固醇类生物碱、挥发油、维他命等化合物[5-7]。深入研究洋常春藤的化学成分及生理活性，对于开发其药用价值具有重要的经济意义和社会效益。

药理研究表明，常春藤皂苷是洋常春藤止咳化痰和抗炎的主要活性成分[8-9]，黄酮类和有机酸类化合物亦具有抗炎等药效[10]。化学成分分析是对洋常春藤进行药学研究的首要条件。目前，洋常春藤化学成分的定量分析主要采用高效液相色谱法(HPLC)，例如文献[11-13]建立了测定洋常春藤中皂苷类物质的HPLC方法；文献[14]建立了测定绿原酸、芦丁、烟花苷、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D和α-常春藤皂苷6种成分的HPLC方法；文献[15]建立了测定绿原酸、芦丁、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D、川续断皂苷乙、常春藤皂苷B和α-常春藤皂苷8种成分的HPLC方法，但上述方法的分析时长均在60 min以上。超高效液相色谱法(UHPLC)由于具有检测时间短、溶剂用量少、高效、环保等优点而被广泛应用。为最大程度地保留药材中的化学成分，并进行更全面、快速的成分分析，本文采用UHPLC法在27 min内对洋常春藤中的绿原酸和隐绿原酸2种有机酸，芦丁、烟花苷2种黄酮类化合物以及常春藤皂苷C(HDC)、常春藤皂苷D(HDD)、常春藤皂苷B(HDB)和α-常春藤皂苷(α-H)4种主要皂苷成分进行同时定量分析，可为洋常春藤的药学研究提供支持。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Thermo UltiMate 3000高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific有限公司)；ML104/02电子分析天平(Mettler Toledo有限公司)；M2P百万分之一电子天平(Sartorius仪器系统有限公司)；DS-3510 DTH超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)；UPK-I-10T去离子水机(四川优普超纯科技有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；FW177中药粉碎机(天津泰斯特仪器公司)；DHG-9070A电热鼓风干燥箱、HWS-28电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；无水甲醇、无水乙醇(分析纯，上海泰坦科技有限公司)；磷酸(优级纯，上海麦克林生化科技有限公司)；甲酸(98%，上海凌峰化学试剂有限公司)；超纯水为实验室自制。

以洋常春藤干燥叶为研究对象，鲜叶采摘于浙江杭州和江苏沭阳，分别于不同温度下烘干至恒重，由浙江康恩贝中药有限公司提供。样品经中国中医科学院中药研究所陈士林教授鉴定为五加科常春藤属常春藤HederahelixL.。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品溶液的配制精密称取8种待测物对照品，以80%甲醇溶解，配成绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、HDC、HDD、HDB和α-H质量浓度分别为 0.108 1、0.105 0、0.118 4、0.109 3、1.032 2、1.023 3、0.948 4、1.062 5 mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备供试品溶液：称取干燥药材粉末(过40目筛)约0.5 g，以料液比1∶100加入80%甲醇，置于85 ℃水浴回流1 h，放冷，以80%甲醇补足失重，过0.22 μm有机相滤膜，取续滤液即得。

阴性供试品溶液：按照上述方法制备不含待测物的阴性供试品溶液。

1.3.3 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；检测波长：205 nm；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL；流动相：A为0.05%磷酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱方式：0～3 min，5%～16%B；3～8 min，16%～19%B；8～9 min，19%～28%B；9～13 min，28%～31%B；13～14 min，31%～53%B；14～17 min，53%～65%B；17～17.1 min，65%～5%B；17.1～27 min，5%B。

图1 不同流动相时的UHPLC色谱图Fig.1 UHPLC chromatograms with different mobile phasesA.acetonitrile-water,B.acetonitrile-0.05%formic acid,C.acetonitrile-0.05%phosphoric acid;peaks：1.chlorogenic acid,2.cryptochlorogenic acid,3.rutin,4.nicotifiorin,5.HDC,6.HDD,7.HDB,8.α-H

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的组成考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.05%甲酸溶液等流动相体系的分离效果。结果表明，由于本实验采用紫外检测器，而甲醇的截止波长在205 nm左右，有机相使用甲醇会对测定影响较大，且系统压力较高，对仪器及色谱柱损伤较大；采用乙腈在相同的流速和比例下系统压力较小，且在短波长处乙腈的吸收小，不干扰目标物质测定，此外乙腈的洗脱能力较强，有利于目标物质的分离，因此有机相选用乙腈。

进一步研究发现，以乙腈-水为流动相时，绿原酸和隐绿原酸不出峰(图1A)；以乙腈-0.05%甲酸溶液为流动相时，基线漂移较为严重(图1B)；而以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相时8种目标物质均出峰(图1C)，同时解决了基线漂移问题，因此采用乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相。

2.1.2 梯度条件的优化洋常春藤中的有机酸、黄酮类和皂苷类成分的极性差别较大，故采用梯度洗脱程序。其中，绿原酸和隐绿原酸为同分异构体，两者极性相近较难分离，有机相比例约在16%～18%时洗脱完全；芦丁和烟花苷的极性相近较难分离，有机相比例约在28%～30%时洗脱完全；HDC和HDD的极性相近较难分离，有机相比例约在35%～38%时洗脱完全；HDB和α-H约在有机相比例为60%时洗脱完全。为使8种化学成分均能出峰，且极性相近物质的分离度达到要求和缩短测定时间，确定最佳梯度条件如“1.3.3”所示。

随着时代的变化，现如今的中学生大都有着较差的独立性，因此不管是在个人卫生方面还是在学习中的集体卫生方面都做得不到位，这样的坏习惯也为传染性疾病提供了有力的条件。其次现阶段的中学生有较强的懒惰性，不注重身体的锻炼，也使得自身的身体素质较差，很容易被疾病感染。所以在教学中教师可以采取有效的教学手段，培养学生养成良好的卫生和生活习惯，加强学生对于疾病的防范意识。

2.1.3 检测波长的选择采用紫外可见分光光度法在200～400 nm对8种成分的对照品溶液进行全波长扫描，结果显示绿原酸和隐绿原酸的最大吸收波长约为219 nm，芦丁和烟花苷的最大吸收波长约为214 nm，HDC、HDD、HDB和α-H的最大吸收波长分别约为205、203、207、209 nm。由于皂苷类物质仅在低波长下有紫外吸收，为使所有物质均能出峰，本文选择低波长进行检测。

采用二极管阵列检测器对样品在190～800 nm波长进行紫外全波长扫描，结果显示洋常春藤中的皂苷类物质在205 nm处有较强吸收，高波长处无紫外吸收。为检测到更多的色谱峰，并使各主要成分的色谱峰响应最高，最终选择最佳检测波长为205 nm。

2.2 方法学考察

2.2.1 系统适应性及方法专属性分别精密吸取“1.3.1”和“1.3.2”中的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各2 μL，按“1.3.3”色谱条件进样分析。结果显示：供试品溶液中8种化学成分的色谱峰与混合对照品中各色谱峰的保留时间相对应(图2)，阴性样品在相应位置处未出峰，表明提取溶剂和提取方式对8种化学成分的测定无干扰，方法专属性良好。各化学成分间的分离度均在1.5以上，峰形对称，拖尾因子均在1.5以下，理论塔板数均不低于40 000(见表1)。

AnalyteRegression equationCorrelation coefficient(r)Linear range(mg·mL-1)Theoretical plate numberResolutionChlorogenic acid(绿原酸)y=192.238 6x-0.376 80.999 70.005 1～0.108 146 8912.45Cryptochlorogenic acid(隐绿原酸)y=157.375 7x-0.373 60.999 50.005 2～0.105 048 27924.04Rutin(芦丁)y=426.169 2x+0.128 90.999 90.004 8～0.118 4103 7847.05Nicotifiorin(烟花苷)y=344.104 2x-0.078 00.999 60.004 8～0.109 3227 5304.30HDC(常春藤皂苷C)y=23.389 5x+0.165 60.999 90.041 9～1.032 2392 6943.02HDD(常春藤皂苷D)y=23.081 2x-0.180 00.999 80.045 0～1.023 3475 4126.73HDB(常春藤皂苷B)y=24.757 9x+0.067 30.999 80.039 5～0.948 4857 0454.65α-H(α-常春藤皂苷)y=45.269 6x+0.138 40.999 80.043 8～1.062 5897 2382.06

2.2.2 线性关系取“1.3.1”中混合对照品溶液，分别稀释2、5、10、25倍，按“1.3.3”色谱条件进样分析，以峰面积(mAU·min)为纵坐标(y)，对照品的质量浓度为横坐标(x，mg·mL-1)进行线性回归。由表1可知，各成分在相应质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数r≥0.999 5，符合分析要求[16]。

2.2.3 检出限与定量下限取“1.3.1”中配制的混合对照品溶液，逐级稀释，按“1.3.3”进样分析，分别以信噪比(S/N)为3和10时对应的质量浓度作为检出限及定量下限，测得绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、HDC、HDD、HDB和α-H的检出限分别为0.42、0.67、0.40、0.60、2.62、7.29、10.58、8.76 μg·mL-1，定量下限分别为1.45、2.24、1.31、2.00、8.38、23.25、34.61、29.20 μg·mL-1。

2.2.4 精密度实验称取1份洋常春藤干燥叶粉末(批号HZ170402)约0.5 g，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，按“1.3.3”色谱条件重复进样测定6次。结果显示，绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、HDC、HDD、HDB和α-H峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.61%、0.67%、0.64%、0.68%、0.61%、0.57%、0.59%、0.63%，表明仪器精密度良好，符合分析要求[16]。

2.2.5 重复性实验平行称取6份洋常春藤干燥叶粉末(批号HZ170402)各约0.5 g，按“1.3.2”方法制备成6份供试品溶液，按“1.3.3”色谱条件进样分析。结果显示，绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、HDC、HDD、HDB和α-H峰面积的RSD分别为1.9%、1.4%、1.7%、1.1%、0.64%、0.78%、0.59%、1.3%，表明方法重复性良好，符合分析要求[16]。

2.2.6 稳定性实验称取1份洋常春藤干燥叶粉末(批号HZ170402)约0.5 g，按“1.3.2”方法制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h按“1.3.3”色谱条件进样分析。结果显示，绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、HDC、HDD、HDB和α-H峰面积的RSD分别为0.22%、0.55%、0.30%、0.25%、0.39%、0.67%、0.38%、0.29%，表明样品溶液中各化学成分在室温条件下24 h内稳定性良好，符合分析要求[16]。

2.2.7 加标回收率实验取已知含量的供试品溶液(药材批号：HZ180801)6份，分别加入一定量的对照品，使绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、HDC、HDD、HDB、α-H的加标水平分别为0.013 5、0.013 7、0.014 6、0.008 7、0.103 9、0.018 4、0.019 2、0.101 4 mg，按“1.3.3”色谱条件进样分析。测得上述成分的平均加标回收率分别为106%、102%、106%、106%、100%、97.3%、108%、101%，RSD分别为2.2%、2.8%、0.81%、0.51%、3.2%、0.91%、1.6%、2.4%。供试品溶液中除HDC和α-H外，其它6种组分的含量均小于1%，平均回收率均符合相应要求[16]，表明该方法的准确度良好。

2.3 样品的测定

取10批洋常春藤干燥叶，按“1.3.2”方法制备成供试品溶液，按“1.3.3”条件进行测定，结果见表2。结果表明，8种成分在不同批次洋常春藤中的含量存在较大差异，其中HDC和α-H的含量相对较高，说明药材产地、采摘期和炮制温度均会对其含量产生影响。

表2 不同批次洋常春藤干燥叶中8种成分的含量Table 2 Contents of eight compounds in Hedera helix L.leaves in different batches

3 结 论

本文建立了同时测定洋常春藤中绿原酸、隐绿原酸、芦丁、烟花苷、常春藤皂苷C、常春藤皂苷D、常春藤皂苷B和α-常春藤皂苷含量的UHPLC方法。结果表明，该方法准确度高、重复性好，可用于洋常春藤中主要化学成分的快速定量分析，亦可用于洋常春藤提取物及制剂的含量分析，为建立洋常春藤药材、提取物及制剂的质量标准提供了依据。