甘草苷治疗抑郁症和糖尿病共病的网络药理学作用机制研究

刘 鹏，田俊生

1山西药科职业学院；2山西大学中医药现代研究中心，太原 030006

甘草(GlycyrrhizaeRadixetRhizoma)为豆科植物甘草(GlycyrrhizuralensisFisch)，光果甘草(Glycyrrhizaglabral)或胀果甘草(GlycyrrhizainflateBat)的根茎[1]，主要活性成分是三萜皂苷、黄酮类、多糖等化合物。现代药理研究结果表明甘草及其主要活性成分具有抗氧化，抗肿瘤、保护神经元、抗炎、抗抑郁、降血糖[2]等多种功效。

甘草苷(liquiritin，LQ)是甘草水提物中的主要活性成分，属于黄酮类化合物。文献报道甘草苷具有广泛的药理活性，主要涉及抗衰老、抗凋亡、抗炎、防辐射、抗抑郁、神经保护、降血糖[2]等。其中，Zong等[3]从甘草抗抑郁活性成分及其在中药复方中的应用等方面分析甘草治疗抑郁症的特点，发现其在改善动物行为学和生化指标上都有良好的疗效，其机制主要涉及调节脑内单胺类神经递质及其受体、改善下丘脑-垂体-肾上腺(HPA) 轴功能、抗自由基、抗炎等作用。Zhao等[4,5]研究甘草黄酮对2型糖尿病大鼠血糖、血脂等生化指标的影响，测定大鼠空腹血糖、血脂及肝/体、肾/体、脂/体比值，发现超氧化物歧化酶能明显抑制2型糖尿病大鼠血糖升高和脂代谢紊乱，因此推测甘草苷具有治疗糖尿病的效果。

Hopkins于2007年发表的文章中首次提到“网络药理学”(network pharmacology)的概念，即通过分析药物对疾病的干预作用，构建“成分-靶点-疾病”之间的复杂网络来探讨药物的作用机制[6]。网络药理学研究策略的整体性、系统性特点与中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理异曲同工。与此同时，网络药理学的研究方法与中医药理论相结合，可以推动单药物单靶点向多组分多靶点的研究模式转变，从整体上预测药物靶点信息，为药物研发提供了新的途径和方法[7]。

“异病同治”是中医临床的重要治则，以“辨证论治”理论为基础，也是中医学区别于现代医学的基本特征之一[8]，其科学内涵为异病-同证-同治，即不同疾病在发展过程中，表现出相同或者相似的证候，采用相同的方法来进行治疗[9]。

抑郁症合并糖尿病是临床常见共病之一，其机制主要涉及免疫炎症、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴、氧化应激、BDNF、血清素(5-HT)、胰岛素抵抗等[10]。抑郁与下丘脑-垂体-肾上腺素轴的活动相关，可导致升糖激素增多，胰岛素分泌水平降低。高血糖氧化应激状态下产生的过多自由基，以及与之伴随的高分子氧化损伤可能在糖尿病诱导抑郁的发生过程中起到重要作用。同时，糖尿病引发的神经系统的改变，包括神经递质的改变和神经细胞凋亡的发生等，都可能是其抑郁症高发的原因。

目前，应用网络药理学方法探讨异病同治科学内涵的文献报道较少，因此，本文采用网络药理学的方法探究甘草苷治疗抑郁症和糖尿病的作用机制。

1 方法

1.1 甘草苷作用靶点查询

登陆PubChem服务器(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，2018-5-29)，输入关键词liquiritin，下载甘草苷对应的Isomeric smiles化学式以及sdf格式文件[11]。通过反向药效团匹配PharmMapper数据库(http://59.78.98.102/pharmmapper/get.php，2018-5-29)，上传甘草苷的sdf格式文件，点击Upload，按照软件设定配体空腔要求选择Pharmacophore Models Whose Pkd ≥ 6.0，查询出与甘草苷有关对应根据匹配度fit score 由高到低排序前300的靶点。登陆SEA(http://sea.bkslab.org/，2018-5-29)、SIB(http://www.swisstargetprediction.ch/，2018-5-29)数据库，输入甘草苷的Smiles化学式，将得到的对应靶点信息与反向预测得到的靶点信息进行汇总。

1.2 抑郁症和糖尿病靶点映射

登陆GeneCards(http://www.Genecards.org/,released in 2018-5-30) 和DrugBank(https://www.drugbank.ca/，released in 2018-04-02)数据库输入抑郁症搜索已经报道的与抑郁症或糖尿病有关的靶点，将查询结果与甘草苷相关靶点之间进行匹配。

从STRING(https://string-db.org/，released in 2018-5-30)数据库中分别查找抑郁症和糖尿病各相关蛋白-蛋白之间的相互作用关系，分别上传筛选出的甘草苷与抑郁症，甘草苷与糖尿病相同的蛋白靶点，选择Homo sapiens，Exports下载TSV形式数据。蛋白互作网络(PPI)分析STRING数据库，主要用于搜索已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用关系。其中，需要用到Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/，released in 2018-5-30)中的Uniprot 工具对蛋白名称进行校正，选取物种为人，把所有预测出的蛋白靶点名称中的Uniprot ID转换成Official Gene Symbol。

Cytoscape 3.6.0是一款图形化显示网络并进行分析和编辑的软件，可用于蛋白与蛋白之间复杂的相互作用关系分析。运用网络分析(network analyzer)工具分析中心度(betweenness centrality)和节点度(degree)两个网络拓扑参数[12]，计算网络中betweenness和degree 分布等基本属性，可对整个网络成分-靶点-疾病性质进行评价[13]。可借助网络可视化手段分析图中成分、靶点、疾病用节点(node)表示，对应关系用边(edge)表示，边的粗细，颜色深浅，以及节点大小，均表示两个蛋白靶点间相互作用关系的强弱。

1.3 甘草苷治疗抑郁和糖尿病共有靶点筛选

将预测出的甘草苷治疗抑郁和糖尿病潜在作用靶点进行对比，即可筛选出甘草苷治疗抑郁症和糖尿病的相同潜在作用靶点，将筛选出的相同作用靶点作为研究对象再做进一步的分析。

1.4 甘草苷治疗抑郁和糖尿病通路富集分析

通过在线工具DAVID(https://david.ncifcrf.gov/，2018-6-1)对甘草苷生物学过程进行GO富集分析(Gene Ontology biological process)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway)通路注释分析[14]，生物学信息注释数据库，可从大量的基因或蛋白质中提取有意义的生物信息，能够快速识别最重要的富集生物注释[11](其中设定阈值P-value < 0.05表现为显著富集)。

1.5 组织特异性遗传数据筛选共有靶点

BITOLA是一种基于交互式的生物医学发现系统，用于搜索与“基因或基因产物”相关的所有中间概念，在BITOLA系统中，中间概念目前包含医学主题词(MeSH)，用于指导Medline以及人类基因组织(HUGO)的人类基因。该系统的主要目的是通过发现生物医学概念之间潜在的新关系为实验者提供新线索和治疗疾病的新策略[15]。临床上，抑郁症和糖尿病分别影响大脑和肺胃肾等组织。因此，“基因或基因产物”必须在这些组织中表达。因此使用人类EFP浏览器来筛选靶点是否在大脑和肺胃肾等组织中表达最强。人类EFP浏览器使用户能够直接在人体的表示上可视化大规模的人类基因表达数据集。我们首先输入基因符号，然后选择“绝对”的解释方式，选择“神经”和“骨骼免疫消化”(糖尿病涉及的脏器)的数据源。点击“Go”后，根据相关靶点的表达水平对样本进行着色，生成表达“分析图”，以确定靶点在该部位是否表达最强。将治疗抑郁症和糖尿病共同的潜在作用靶点输入BITOLA(http://bar.utoronto.ca/efp_human/cgi-bin/efpWeb.cgi)系统进行检索分析。

2 结果

2.1 甘草苷作用靶点查询

通过数据库PharmMapper、SEA、SIB共筛选出与甘草苷相关的靶点共323个，包括PharmMapper数据库查询275 个，SEA中共查询出33个人类相关蛋白靶点，SIB数据库中共查询出15个相关蛋白靶点，使用UniProt数据库中的UniproKB工具进行更正后，去除与人类无关以及无对应关系或者重复的靶点后，共筛选出包括HRAS、ESR1、VEGFA、IL2在内的312个蛋白靶点。

2.2 疾病靶点的筛选

GeneCards数据库和DrugBank 数据库中筛选出抗抑郁的靶点与甘草苷相关的靶点进行映射，结果显示有42个靶点为甘草苷抗抑郁的潜在作用靶点，将筛选出的作用靶点导入STRING数据库。STRING导出数据用Cytoscape 3.6.0可视化分析的结果如图1所示。共导入42个蛋白，有6个与其他蛋白无相互作用关系，最终的蛋白相互作用关系网络中degree >10的排名如表1所示。

图1 抗抑郁有关蛋白相互作用网络图Fig.1 Protein interaction network of depression

序号No.节点度数Degree中心度数Betweenness centrality靶点名称Target name1170.16ESR12160.096HRAS3160.11VEGFA4130.18NOS35130.071PTGS26120.12IL27120.033NOTCH18110.016IGF1R9110.16BDNF10110.11PARP1

同理，GeneCards数据库和 DrugBank数据库中筛选出糖尿病的靶点与甘草苷相关的靶点进行映射，结果显示有55个靶点为甘草苷治疗糖尿病的潜在作用靶点，将筛选出的潜在作用靶点导入STRING数据库。STRING导出数据用Cytoscape 3.6.0可视化分析的结果如图2所示。最终degree>10的蛋白排名如表2所示。

图2 糖尿病有关蛋白相互作用网络图Fig.2 Protein interaction network of diabetes

序号No.节点度数Degree中心度数Betweenness centrality靶点名称Target name1240.32VEGFA2180.039HRAS3170.066IGF1R4160.084ESR15150.12NOS3

续表2(Continued Tab.2)

序号No.节点度数Degree中心度数Betweenness centrality靶点名称Target name6150.017FGF27130.060IL28130.010PTGS29130.010NOTCH110110.082GSK3B11110.16DPYD

2.3 不同疾病的共同靶点筛选

采用Cytoscape3.6.0软件构建甘草苷治疗抑郁症的潜在作用靶点与甘草苷治疗糖尿病的潜在作用靶点之间相互关系网络图，如图 3所示，从图中可以看出，甘草苷治疗抑郁症和糖尿病的共同作用靶点为ESR1、HRAS、VEGFA、NOS3、PARP1、IL2、NOTCH1、IGF1R等共23个。

图3 抑郁症和糖尿病作用靶点网络图Fig.3 Network map of targets for depression and diabetes

2.4 通路富集分析

GO富集分析结果如图4所示，其中甘草苷在糖尿病和抑郁症治疗中的潜在作用靶点GO富集分析过程包括生物过程(BP))、细胞组分 (CC)和分子功能(MF)[16]。排名靠前的过程有protein binding (17个靶点，MF)、plasma membrane (12个靶点，CC)、membrane (10个靶点，CC)、positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(8个靶点，BP)、extracellular region (7个靶点，CC)、enzyme binding (7个靶点，MF)、singal transduction (7个靶点，BP)、positive regulation of cell proliferation (6个靶点，BP)、golgi membrane (5个靶点，CC)、positive regulation of angiogenesis(5个靶点，BP)、positive regulation of cell migration(5个靶点，BP)、oxidation-reduction process(5个靶点，BP)。在生物过程方面，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录过程，信号转导，细胞增殖，氧化还原的过程与抑郁症和糖尿病的发生发展中有密切的关系。在细胞组成方面，细胞质膜，胞外区与高尔基膜可能是药物作用与抑郁症和糖尿病的靶点位置。在分子功能方面，与蛋白结合与酶结合是药物与抑郁症和糖尿病的靶点作用的方式。由此可见，甘草苷可能通过多通路，多途径的形式治疗抑郁症和糖尿病。

KEGG代谢通路富集分析结果如图5所示，其中导入的23个潜在作用靶点涉及的通路富集主要有PI3K-AKT(9个靶点)、癌症信号通路(7个靶点)、Ras 信号通路(6个靶点)、Rap1信号通路(6个靶点)等，表明甘草苷相关靶点是通过调节这些通路起到治疗抑郁症和糖尿病的作用。

图4 治疗抑郁症和糖尿病相同靶点生物学过程GO富集分析Fig.4 Analysis of GO enrichment in the biological process of the same targets in the treatment of depression and diabetes

图5 治疗抑郁症和糖尿病相同靶点KEGG信号通路富集分析Fig.5 Analysis of KEGG pathways of the same targets in the treatment of depression and diabetes

2.5 组织特异性遗传数据筛选共有靶点

我们使用人类EFP浏览器检测了大脑和肺胃肾等组织靶点的基因表达模式[13]。PARP1和VEGFA在大脑和肺胃肾等均有表达，其中，PARP1和VEGFA两个靶点均显示其在大脑和肺胃肾等组织靶点的基因表达较高。

3 讨论

本文通过预测分析，结果显示23个靶点为甘草苷治疗抑郁症和糖尿病的共同作用靶点，甘草苷相关靶点通过影响PI3K-AKT、Cancer、Ras、Rap1等信号通路进一步调控抑郁症和糖尿病的发病机理。

PPI分析选取degree>10得到的结果中，甘草苷抗抑郁潜在作用靶点中关联度较大的蛋白有ESR1、HRAS、VEGFA、NOS3、PTGS2、IL2、PARP1。Cui J等[17]通过实验研究分析大鼠抑郁模型中血管内皮生长因子(VEGFA)和microRNA(miRNA/miR)-27a在海马组织和血清中的表达情况。结果表明，与正常组相比，抑郁模型大鼠海马外周血中VEGFA mRNA蛋白表达量较低，可通过调节VEGFA含量进一步调控抑郁症。Qu[18]通过实验证明高糖可诱导PARP1蛋白表达量升高且高糖所致心肌细胞肥大与PARP1激活有关，而本实验结果也证明PARP1蛋白在抑郁症调节机制中起主要的调控作用。

甘草苷治疗抑郁症潜在作用靶点中关联度较大的蛋白有VEGFA、HRAS、IGF1R、ESR1、NOS3、FGF2、IL2。Liu等[19]通过实验验证sIL-2R，IL2和T细胞转化活性的关系，结果表明sIL-2R可阻断IL2蛋白与T细胞结合，从而导致糖尿病。Zhang等[20]通过实验证明成纤维细胞生长因子2(FGF2)在糖尿病发生、发展过程中起到重要作用。

为了进一步说明这些相同的作用靶点在治疗抑郁症和糖尿病方面的作用，本文通过DAVID分析对甘草苷治疗抑郁症和糖尿病预测出的相同靶点进行GO生物功能分析和KEGG代谢通路富集分析。GO功能分析表明，甘草苷在治疗抑郁症和糖尿病的功能方面主要体现在蛋白质结合、酶结合、血管生成正调控等方面。KEGG代谢通路富集结果表明，靶点主要涉及PI3K-AKT信号通路、癌症信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路等方面。其中BRCA1、HRAS、KITLG、FGF1、IGF1R、IL2、NRAS、NOS3、VEGFA共9个靶点共同参与调控PI3K-AKT通路进而发挥治疗抑郁症和糖尿病的作用。Sun等[21]通过实验研究发现，高糖可通过调节PI3K-AKT信号通路抑制血管内皮细胞的迁移、增殖和血管生成。HRAS、KITLG、FGF1、IGF1R、NRAS、PTGS2、VEGFA共7靶点共同参与调控癌症信号通路，HRAS、KITLG、FGF1、IGF1R、NRAS、VEGFA共6个靶点参与调控Ras 信号通路，Wang等[22]通过研究表明Ras相关信号通路与抑郁症治疗、抑郁状态神经可塑性以及抑郁症相关神经营养因子均有很强的相关性，它在细胞内信号通路的调节中发挥重要的作用。HRAS、KITLG、FGF1 、IGF1R、NRAS、VEGFA 共6个靶点通过调控Rap1信号通路发挥治疗抑郁症和糖尿病的作用，其中Rap1信号通路与Ras 信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路均有关联，表明Rap1在甘草治疗抑郁症和糖尿病过程中发挥重要作用。Wu等[16]的研究结果证明柴胡通过调控PI3K-AKT、MAPK、Rap1、Ras等通路发挥抗抑郁作用，与本研究结果基本相符。

BITOLA系统能够直接将人类基因表达数据集可视化，从图中可以看出PPAPR1和VEGFA在治疗抑郁症和糖尿病作用中表达较高，丘脑核、脊髓等作用部位的高表达量也为临床上研究抑郁症和糖尿病提供了方向。通过使用BITOLA系统可以制定一个新的假设:PPAPR1和VEGFA被识别为参与治疗抑郁症和糖尿病相互作用，这些结果为实验者提供了新的线索，成为治疗这两种疾病的新策略。

BITOLA是一个基于文献的交互式生物医学发现支持系统。该系统的主要目的是通过发现医学概念之间潜在的新关系，帮助研究人员做出新的发现。本文发现23个靶点为甘草苷治疗抑郁症和糖尿病的共同作用靶点，这些基因或基因产物可能在抑郁症和糖尿病之间的通讯中起更为重要的作用。采用BITOLA中不同组织中基因或蛋白的表达，进一步发现PPAPR1和VEGFA在抑郁症和糖尿病相关的组织中有较高的表达量。该研究为后续基因或蛋白的验证及组织部位的选取提供了参考。

本文采用网络药理学方法研究甘草苷治疗抑郁症和糖尿病的作用机制，发现甘草苷可通过调控同一潜在作用靶点、相同作用机制，药效分子作用于相同的部位发挥治疗抑郁症和糖尿病的作用，为中医理论异病同治作用机理的深入研究提供了新的方法和思路。