长双歧杆菌BB68S体内及体外安全性评价

张晓妹，葛绍阳，桑跃，刘治麟

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.河北省畜产食品技术创新中心，廊坊 065201；3.北京和益源生物技术有限公司，北京 100089）

益生菌是一种活的微生物，当摄入达一定量时能够对人体健康起到促进作用。其形态学、生化特性、生理功能和临床应用的研究已经受到人们的广泛认可[1]。近年来，随着研究技术的发展，人们对乳酸菌在人类健康及疾病中的作用有了更加全面及深入的认识，多种益生菌的生理活性功能得到开发利用，益生机制得到了深入的研究，包括改善肠道炎症[2]、免疫调节、脂代谢调节[3,4]、预防过敏性疾病[5]等。

乳酸菌已经有较长的应用历史，长期以来乳酸菌被人们应用于酸奶发酵工艺中。另外，在天然发酵奶油的基础上，结合乳酸菌的发酵方式可以得到人工发酵奶油。干酪作为食品已有9 000年历史了，干酪的制作过程也是利用乳酸菌对乳酪蛋白进行固化和压缩处理。因此，在长期的应用过程中许多乳酸菌及其产品被公认是相对安全的。但是与此同时一些潜在的安全问题是不容忽视的，人们对乳酸菌安全性的认识仍然不足。Gasser[6]在1994年的报道中称乳酸菌引起的心肌膜炎占0.05%～0.4%，而链球菌-葡萄球菌引起的心肌膜炎比例高达79.3%。Donohue等[7]认为乳酸菌中大多数乳杆菌是安全的，而链球菌和肠球菌属的某些菌株为条件致病菌。

目前国际上对乳酸菌安全性的关注主要在以下几方面：①感染能力。虽然大多数乳酸菌在长期使用过程中被认为是 “相对安全” 的，但已有相关报道指出乳杆菌、肠球菌等乳酸菌的摄入会引起菌血症、心内膜炎感染等疾病[8]。②产生有害的代谢产物。在正常人的肠道中，肠道菌具有的氨基脱羧酶活性可将游离的氨基酸转化为生物胺类物质，而过量生物胺类能够引起恶心、呕吐、发烧等食物中毒的症状。③耐药性及携带耐药基因。可耐受抗生素的乳酸菌会分泌具有降解抗生素作用的酶，也可能会把耐药基因转移给其他细菌。因此，有必要对益生菌进行以上的安全性评价。

1 材料和方法

1.1 菌株

长双歧杆菌BB68S，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC No. 14168，由中国农业大学功能乳品实验室提供。金黄色葡萄球菌ATCC 25923，购自中国普通微生物保藏中心。

1.2 培养基

脱羧酶培养基：胰蛋白胨5g、酵母粉5g、牛肉膏5g、氯化钠2.5g、葡萄糖0.5g、吐温80 1g、MnSO40.5g、MgSO40.2g、FeSO40.04g、硫胺素0.01g、K2HPO42g、CaCO30.1g、溴甲酚0.06g、5’-磷酸吡哆醛0.05g、前体氨基酸5g，加去离子水至1L，调pH值至5.3～5.5，115℃灭菌20min。

MRS琼脂培养基和MH琼脂培养基，购自北京陆桥生物技术公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抗生素敏感性检测

采用药敏纸片琼脂扩散法。BB68S和金黄色葡萄球菌ATCC 25923分别接种于MRS琼脂培养基和MH琼脂培养基，待表面干燥后把抗生素纸片放置在上面，37℃培养24h后，测定抑菌圈大小。

1.3.2 生物胺检测

待测菌株在MRS培养基中活化2次；在含0.1%前体氨基酸（酪氨酸、组氨酸、精氨酸、鸟氨酸）和0.005%磷酸吡哆醛-5-磷酸的MRS培养基中传代5次（以此诱导脱羧酶）；将活化菌株接入脱羧酶培养基，培养4d，观察培养基颜色及测定培养基pH值，取样进行衍生，测定生物胺[9]。

1.3.3 动物试验设计

SPF级Balb/C小鼠，6～8周龄，雌性。饲养于SPF级动物房：温度22±2℃，相对湿度55%±2%，12h灯照/黑暗循环，自由饮水和摄食。将小鼠随机分为4组（每组10只）：灌胃组（3个组），分别以每天5×108cfu/鼠、5×109cfu/鼠和5×1010cfu/鼠BB68S剂量灌胃28d（每只小鼠每天0.2mL）；对照组，用生理盐水灌胃。试验期间每天观察小鼠的一般表观、中毒表现和死亡情况，每周记录小鼠的体重、摄食量。

1.3.4 血生化和血常规指标检测

取小鼠全血用全自动血液分析仪（ H i t a c h i , Japan）检测血常规项目，包括：红细胞（RBC）、血小板、 血细胞压积（ H C T ）、 平均红细胞体积（MCV）、血红蛋白、平均血红蛋白浓度（MCHC）。全血离心取血清，用全自动生化分析仪检测生化项目，包括：丙氨酸转氨酶（GOT）、天冬氨酸转氨酶（GRT）、总蛋白（TP）、白蛋白、血糖（GLU）、胆固醇。

1.3.5 细菌移位能力评价

分析小鼠血、肝脏、脾脏及肾脏的细菌移位情况。将50μL小鼠血涂布于MRS平板及BHI平板，于37℃下分别厌氧及有氧培养48h，计数平板上的菌落数。取组织样品，以1g/mL悬滴于无菌生理盐水中，匀浆后取100μL分别涂布于MRS平板及BHI平板，按血样同样方法培养，计数平板上的菌落数。有菌落生长即记为阳性。

1.3.6 统计分析

试验结果以均值±标准差（±SD）表示。采用SPSS17.0进行统计分析，不同处理方法之间均值比较采用单因素方差分析进行差异显著性检验，不同处理之间移位率比较采用卡方检验，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 抗生素敏感性

已有多篇文献报道干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌以及植物乳杆菌等乳酸菌天然对糖肽类抗生素如万古霉素具有普遍耐受性。表1结果表明，BB68S对氨基糖苷类、喹诺酮类、糖肽类部分抗生素及氨曲南的敏感性为R或者I，这与文献报道的氨基糖苷类、喹诺酮类抗生素及胺曲南对革兰氏阳性菌效果普遍较差相符。从检测范围分析，菌株BB68S不存在种属保守耐性以外的抗生素耐受性。菌株的这种固有耐性多为菌株纵向遗传获得，而非基因横向转移，耐性的转移风险小。

2.2 生物胺检测

脱羧酶培养基中溴甲酚紫的有效指示范围为pH 5.2～6.8，pH值在5.5时呈黄色，稍大于5.5就会出现颜色变化，呈现紫色或紫红色。BB68S在改良脱羧酶液体培养基培养4d，相对于空白对照培养基，添加了鸟氨酸、组氨酸、酪氨酸及精氨酸这四种不同氨基酸的液体培养基均呈现浑浊状态，表明乳酸菌在其中可以正常生长，而各培养基均呈黄色，表明菌株生长并未导致培养液pH值升高，初步判断菌株未产生胺类物质。

表1 试验菌株药物敏感性能

2.3 口服BB68S急性毒性试验

血常规指标异常可反映试验菌株在血液中的副作用，血生化指标异常可反映营养不足及代谢失衡的状况，这些指标的变化通常早于其他的临床症状。表2结果显示，试验组和对照组血常规和血生化指标未发生任何显著变化，说明试验菌株对试验动物无不利影响。

表2 经口灌胃组血常规指标（n=10）

2.4 细菌移位检测

细菌移位是益生菌安全性的最严重问题之一。益生菌移位可能引发感染，包括菌血症、败血症或心内膜炎等[10,11]。因此，评价益生菌的移位能力是十分重要的。表3结果表明，对照组和试验组的组织和血液样本经过培养后，各培养基上无菌落生长，表明试验动物的组织和血液没有受到污染，菌株没有从肠道转移到组织和血液中，未发生移位现象。

表3 经口灌胃组小鼠被试菌转移到肝、脾、肾和血液的移位率

3 结论

长双歧杆菌BB68S不存在种属特有耐性以外的抗生素耐受性，不存在抗生素转移的风险；产胺试验未发现生物胺的产生。口服不同剂量试验菌（108cfu/鼠、109cfu/鼠、1010cfu/鼠），小鼠均未发生不良反应，试验菌未发生血液、肝脏、脾脏和肾脏的移位，表现出较高的移位安全性。长双歧杆菌BB68S安全性评价未发现菌株的不安全因素。