基于网络药理学预测膈下逐瘀汤治疗炎症性肠病的作用机制Δ

杨 桃，杨向东，文建霞，高思佳，赵艳玲

(1.成都中医药大学临床医学院，四川 成都 610075； 2.成都肛肠专科医院肛肠科，四川 成都 610075； 3.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 4.中国人民解放军总医院第五医学中心药学部，北京 100039)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是肠道慢性炎症性疾病的统称，包括溃疡性结肠炎、克罗恩病及慢性结直肠炎等亚型。据统计，IBD全球发病率>0.3%[1]。IBD具体病因病机尚未被系统阐明，可能由肠道菌群失调、肠黏膜屏障功能缺陷和宿主免疫功能紊乱所致[2]；饮食、生活习惯等非遗传易感性因素亦参与其发生[3-4]。IBD已明显增加了社会及患者的经济负担，严重降低了患者的生活质量[5]。根据“分级、分期和分段”治疗原则，IBD目前的治疗药物包括糖皮质激素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和环孢素A等免疫抑制剂，以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)抑制剂等生物制剂；但长期使用可导致机体免疫功能进一步紊乱、细菌感染、淋巴瘤、神经系统脱髓鞘病变及充血性心力衰竭等不良反应[6-7]。中医药在IBD的防治方面具有一定优势。膈下逐瘀汤出自《医林改错》卷上，具有活血逐瘀、破瘕消结之功效，主治积聚痞块，痛不移处，卧则腹坠，以及由瘀血所致久泻久痢病症，在临床中已被用于IBD的治疗[8-9]。但其潜在活性成分及药理作用机制尚未被系统阐释。网络药理学可通过“成分-靶点-疾病”网络分析，系统地揭示药物及其活性成分对疾病网络的干预与影响，用于阐释中药多成分、多靶点和多通路的潜在作用机制[10-11]。鉴于此，本研究应用网络药理学分析方法，探索膈下逐瘀汤治疗IBD的潜在药效物质基础及可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 膈下逐瘀汤中药物成分查询及筛选

药物口服后的体内过程[吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)，ADME]受到药物本身属性影响，药物成分中分子量(molecular weight，WM)较大的分子较难经细胞膜的被动转运过程进入血液循环。口服生物利用度(oral bioavailability，OB)代表药物被吸收入血的速度与程度，其值越高，常表示药物的生物利用程度与速度越高。类药性(drug-likeness，DL)指化合物与已知药物的相似性。本研究以WM≤500、OB≥30%和DL≥0.18为成分筛选条件，同时借助中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)及中药系统药理学成分分析平台(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)(http：//bionet.ncpsb.org)，以膈下逐瘀汤中各药物中文名称作为关键词用于检索化学成分。采用Excel 2007软件建立“药物-成分-靶点”数据集。

1.2 膈下逐瘀汤作用靶点的确定及“成分-靶点”网络的构建

基于UniProt(https：//www.uniprot.org)、Malacards(https：//www.malacards.org)及 PubMed数据库，确定IBD靶点所对应基因的官方名称，采用Cytoscape 3.2.1(http：//www.cytoscape.org/)软件构建“成分-靶点”网络，同时基于拟合的作用靶点进行拓扑参数分析，从生物化学、信号转导的角度探究“成分-靶点-疾病”之间的网络相关性。

1.3 膈下逐瘀汤治疗IBD的作用靶点一级交互网络构建

基于构建的“成分-靶点”网络，采用Cytoscape 3.2.1软件进一步构建膈下逐瘀汤中药物活性成分与IBD作用靶点间的一级交互网络，以明确膈下逐瘀汤中各药物及其所含活性成分在IBD治疗中的潜在药理作用。

1.4 膈下逐瘀汤治疗IBD作用靶点的京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析及基因本体(gene ontology，GO)富集分析

为进一步探索上述筛选作用靶点在生物信号通路中的作用，将筛选得到的膈下逐瘀汤的作用靶点导入DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)，设定阈值P<0.05，进行KEGG通路富集分析及GO富集分析，将其结果可视化。

2 结果

2.1 膈下逐瘀汤“药物-成分-靶点”数据集构建结果

根据ADME成分筛选获得膈下逐瘀汤中共含有257种药物有效成分，4 088个药物活性成分靶点，见表1。

表1 膈下逐瘀汤中药物化学成分及成分靶点预测结果Tab 1 Predicting outcomes of chemical components and target spots of Gexiazhuyu decoction

2.2 膈下逐瘀汤治疗IBD的“成分-靶点-疾病”网络构建结果

采用Cytoscape 3.2.1软件构建膈下逐瘀汤治疗IBD的“成分-靶点-疾病”交互网络，结果见图1。图中，三角形表示药物活性成分，圆形表示药物成分靶点，方块表示IBD的疾病靶点，六边形表示交互蛋白，方向标表示活性成分-疾病共同靶点。由图1可知，“成分-靶点-疾病”网络中共有2 915个节点，包括2 270个药物活性成分节点、78个药物成分靶点，40个疾病靶点，488个交互蛋白，39个活性成分-疾病共同靶点。该网络中存在“一药多靶”和“一靶多药”的现象。运用UniProt数据库，查询39个活性成分-疾病共同靶点，并进行各作用靶点拓扑参数分析。经分析，度值最高的前5位靶点(序号1—5)为“PGH2”(前列腺素G/H合酶2)、“PGH1”(前列腺素G/H合酶1)、“NOS2”(一氧化氮合酶2)、“P53”(细胞肿瘤抗原p53)及“MK14”(丝裂原活化蛋白激酶14)，提示其作用靶点配体最多，可作为膈下逐瘀汤治疗IBD的重要作用靶点，见表2。

2.3 膈下逐瘀汤治疗IBD作用靶点的一级交互网络构建结果

基于图1的“成分-靶点-疾病”网络，采用Cytoscape 3.2.1软件进一步构建膈下逐瘀汤中药物活性成分与IBD直接作用靶点的一级交互网络，结果见图2。由图2可知，膈下逐瘀汤中12个药物及其所含的175个有效活性成分参与了膈下逐瘀汤治疗IBD的一级交互网络，该网络依然呈现出“一药多靶”和“一靶多药”的现象，表明各药物及其所含活性成分在IBD的治疗中发挥着关键作用，进一步明确了膈下逐瘀汤治疗IBD“成分明确-靶点清晰”的作用机制。

2.4 作用靶点的KEGG通路富集分析及GO富集分析结果

2.4.1 膈下逐瘀汤治疗IBD的KEGG通路富集分析结果：KEGG通路富集分析能将基因及其表达信息作为一个整体的网络进行研究。将以上靶点上传至DAVID数据库，设定靶点数≥5、P≤0.05。通过KEGG通路富集筛选获得60条相关信号通路，其中与IBD治疗相关潜在通路共30条，采用R软件(3.6.0版)将前20条潜在信号通路可视化，见图3。由图3可知，排首位的为肿瘤坏死因子信号通路，其次为炎症性肠病通路、Toll样受体通路、破骨细胞分化通路及细胞因子-细胞因子受体通路。经系统综合分析当前文献[12-17]，以上5条信号通路为IBD治疗潜在作用机制的重要通路，主要涉及肠道急、慢性炎症反应，肠道菌群多态性失衡，肠黏膜上皮细胞损伤与修复、细胞自噬与凋亡以及机体免疫反应等潜在机制过程。

图1 膈下逐瘀汤治疗IBD的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 Interactive network of “component-target spot-disease” of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

2.4.2 膈下逐瘀汤治疗IBD的GO富集分析结果：GO富集分析可用于衡量基因靶点功能，从生物交互网络角度阐释基因的生物学过程。通过GO富集分析发现，膈下逐瘀汤中活性成分的作用靶标基因主要富集在482个生物学过程和14种分子功能中。本研究分别展示膈下逐瘀汤治疗IBD密切度较高的10种生物学过程及分子功能。生物学过程作用主要为脂多糖应答、菌源性的分子识别、活性氧代谢过程、细胞对生物刺激的反应及对肿瘤坏死因子应答等过程；分子功能主要为细胞因子受体结合、细胞因子活性、生长因子受体结合、蛋白磷酸酶结合及过氧化物酶活性等，见图4—5。图6为基于Cytoscape 3.2.1软件所拟合的网络交互过程图，展示了基因靶点与生物学过程的交互作用，箭头越多，代表交互作用越明显。由图6可知，膈下逐瘀汤治疗IBD与上述生物学过程密切关联的基因靶点主要为“ICAM-1”(胞间黏附分子1)、“IL-1β”(白细胞介素1β)、“TNF-α”(肿瘤坏死因子α)、“TGF-β1”(转化生长因子β1)及“IL-6”(白细胞介素6)等33个关键靶点。

表2 膈下逐瘀汤治疗IBD的作用靶点拓扑参数Tab 2 Topological parameter of target spots of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

图2 膈下逐瘀汤治疗IBD的“成分-靶点”一级交互网络Fig 2 Primary interactive network of “component-target spot” of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

图3 膈下逐瘀汤治疗IBD的KEGG富集分析中前20条潜在通路Fig 3 Top 20 potential pathways in KEGG enrichment analysis of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

图4 膈下逐瘀汤治疗IBD的10种生物过程Fig 4 10 biological process of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

图5 膈下逐瘀汤治疗IBD的10种分子功能Fig 5 10 molecular function of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

图6 膈下逐瘀汤治疗IBD的GO富集分析的网络交互过程Fig 6 Network interactive process of GO enrichment analysis of Gexiazhuyu decoction in treatment of IBD

3 讨论

IBD属于中医学“肠澼”“久痢”及“休息痢”范畴，内因肝、脾、肾亏虚为本，外因复感邪气、饮食不节，使湿热、血瘀壅滞肠腑而发病。膈下逐瘀汤善活血逐瘀、破瘕消结，可用于治疗气滞血瘀之肠澼。本研究通过拟合膈下逐瘀汤治疗IBD的“成分-靶点-疾病”交互关联网络，并通过KEGG通路富集分析及GO富集分析，阐释了膈下逐瘀汤中药物活性成分可通过调节肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体等多条信号通路，并通过调节脂多糖应答、菌源性的分子识别、活性氧代谢及肿瘤坏死因子应答等生物过程，干预肠道急、慢性炎症反应，肠道菌群多态性，肠黏膜上皮细胞损伤与修复过程等可能机制，发挥协同治疗IBD的潜在作用。

肿瘤坏死因子信号转导通路及其调控的上、下游靶点在IBD的发生中扮演着极其重要的角色。肿瘤坏死因子以三聚体形式与胞内信号传输受体肿瘤坏死因子受体1结合后，使肿瘤坏死因子受体1发生构象变化，导致抑制性蛋白死亡结构域沉默蛋白从胞内凋亡结构域解离，衔接蛋白肿瘤坏死因子受体1相关死亡蛋白进而与结构域结合而激活[18]。两者结合后，可通过调节核因子κB的磷酸化激活过程，丝裂原活化蛋白激酶及c-Jun氨基末端激酶通路激活，使多种细胞因子(如白细胞介素1、白细胞介素17、细胞肿瘤抗原p53、c-Jun及激活转录因子2等)募集、趋化作用增强，进而介导炎症反应、免疫反应及细胞凋亡与增殖过程[19-21]。肿瘤坏死因子α为肿瘤坏死因子超家族重要成员之一，本体可作为诱导IBD发生的重要关键炎症介质[22]。肿瘤坏死因子α与肠上皮细胞表达的肿瘤坏死因子受体1结合后，可诱导半胱氨酸-天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依赖型外源性细胞凋亡通路。肠上皮细胞膜上的复合物Ⅰ可通过肿瘤坏死因子受体1胞内转运作用，转化为胞质复合物Ⅱ。Caspase-8的同源二聚体从胞质复合物Ⅱ中释放，裂解并激活Caspase-3，从而导致肠黏膜屏障功能障碍[23]。肿瘤坏死因子α还可通过调控表皮生长因子受体ErbB及Wnt依赖型信号通路，影响肠上皮细胞损伤、修复过程，介导肠上皮细胞产生炎症性凋亡[24]。目前，通过阻断肿瘤坏死因子α相关信号通路的拮抗剂已作为治疗IBD的有效治疗手段被广泛应用于临床[25-26]。根据本研究预测结果，推测膈下逐瘀汤可能通过调节肿瘤坏死因子信号通路，拮抗配体-受体结合激活过程，抑制肿瘤坏死因子α、胞间黏附分子1、白细胞介素1β、细胞肿瘤抗原p53及白细胞介素6等炎性因子的表达，从而发挥抗IBD的潜在治疗作用。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对膈下逐瘀汤治疗IBD的“成分-靶点-疾病”作用机制进行了探索性研究，初步预测了膈下逐瘀汤的基本药理学作用和可能的作用机制，可为系统探讨膈下逐瘀汤的作用机制提供理论基础。