长链非编码RNACBR3-AS1在乳腺癌中的表达及其功能

熊雄，焉正庆，张爱军

（湖北省武汉市武昌医院 普通外科，湖北 武汉 430061）

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，为女性癌症相关死亡的主要原因，尽管癌症诊断和治疗取得一定进展，发展中国家发病率仍在增加，迫切需要进一步探索乳腺癌发病机制并寻找用于乳腺癌检测和治疗的新靶标[1]。乳腺癌进展是一个与遗传和环境因素相关的复杂多步骤过程[2]。长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，参与调控细胞凋亡和周期控制、细胞发育和分化等过程[3]。lncRNA失调与包括癌症在内的人类许多疾病密切相关[4-5]。lncRNA RNA CBR3（CBR3-AS1）最早发现在前列腺癌组织中上调表达并调控细胞增殖和凋亡[6]。尽管如此，CBR3-AS1在乳腺癌中作用和功能尚未完全阐明。本研究旨在探讨乳腺癌组织中CBR3-AS1表达状态，其与患者临床病理参数间的关系和预后价值，并探讨其对乳腺癌细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-453和SKBR3）和正常乳腺上皮细胞系（HS578Bst）购自美国ATCC细胞库。Eagle培养基购自GIBCO公司，TRIzol 和SuperScript III逆转录酶试剂盒购自Invitrogen公司，qRT-PCR试剂盒（RR420）购自日本Takara公司；Transwell小室、基质胶Matrigel购至美国BD公司；ThermoND2000C超微量分光光度计（Thermo）、GeneAmp PCR system 9700扩增仪（PerkinElmer）、LightCycler®480 II System（Roche）。CBR3-AS1干扰序列、阴性对照序列及CBR3-AS1模拟物序列均由上海吉玛生物科技有限公司合成。LipofectamineTM2000购买自美国Invitrogen 公司。凋亡检测试剂盒购买自Sigma公司。

1.2 乳腺癌组织标本

收集我院2013年1月—2015年1月间于我院普外科行乳腺癌切除术的患者组织标本70例，收集患者癌组织标本和对应癌旁组织，从临床病历中收集患者全部临床资料，所有患者均经过病理标本确定为原发性乳腺癌并根据世界卫生组织标准[7]进行乳腺癌病理诊断分类。纳入标准：⑴病理诊断为乳腺癌且不存在其他部位肿瘤；⑵患者手术前未接受放化疗或生物治疗；⑶患者存在完整的病历和随访资料。排除标准：⑴患者存在乳腺癌外其他部位原发性肿瘤；⑵不符合纳入标准者。本研究经医院伦理委员会批准。

1.3 患者随访

患者无瘤生存时间为手术后出院第1天到肿瘤复发时间；总生存时间为手术后出院第1天到死亡时间或随访截止时间，采用门诊或电话方式随访，毎半年随访1次，行乳腺彩超、钼靶或CT检查，随访内容包括肿瘤复发及死亡情况。随访截止时间为2019年3月1日，有4例失访。

1.4 细胞分组及处理

参照文献方法[8]进行细胞转染，将乳腺细胞SKBR3在六孔板上生长至汇合到80%以上时采用LipofectamineTM2000按照制造商说明分别转染CBR3-AS1干扰序列（干扰组）、CBR3-AS1模拟物序列（过表达组）、阴性对照序列（阴性对照组），转染后48 h收获细胞，采用qRT-PCR检测以确定转染效率。所有细胞系在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，培养基为Eagle培养基，取对数生长期且生长良好的细胞用于后续实验。

1.5 细胞活力和细胞凋亡检测

使用MTT细胞增殖/活力测定试剂盒（Sigma，Germany）根据指南进行细胞活力测定。测量并记录每个孔的吸光度（570 nm），细胞活力计算公式=（OD样本/OD对照）×100。根据制造商方案，使用膜联蛋白-V-Fluos（Annexin-V-Fluos）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒通过流式细胞仪评估细胞凋亡率。

1.6 qRT-PCR检测

使用TRIzol从肿瘤标本或细胞系中提取总RNA，并使用SuperScript III逆转录酶试剂盒根据制造商说明书反转录成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq TM II试剂盒在ABI-7500平台（Applied Biosystems，USA）上进行PCR扩增，GAPDH作为内参。CBR3-AS1引物序列，正向：5'-CAG TGG GGA ACT CTG ACT CG-3'，反向：5'-GTG CCT GGT GCT CTC TTAC C-3'。GAPDH引物序列，正向：5'-GTC AAC GGA TTT GGT CTG TAT T-3'，反向，5'-AGT CTT CTG GGT GGC AGT GAT-3'。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 CBR3-AS1在乳腺癌组织和细胞系中上调表达

CBR3-AS1在乳腺癌组织中相对表达量明显高于癌旁组织[（5.6±1.8）vs.（1.8±0.5），P＜0.01]。正常乳腺上皮细胞系HS578Bst的CBR3-AS1相对表达量为2.03±0.42，乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和SKBR3中CBR3-AS1相对表达量分别为6.5±0.8、8.3±0.7、11.9±1.2，乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和SKBR3中CBR3-AS1相对表达量均明显高于正常乳腺上皮细胞系HS578Bst（均P＜0.01）（图1）。

图1 qRT-PCR检测CBR3-AS1的表达 A：乳腺癌组织与癌旁组织；B：正常乳腺上皮细胞系与不同的乳腺癌细胞系Figure1 Determination of CBR3-AS1 expressions by qRT-PCR A:Breast cancer tissues and tumor adjacent tissues；B:Normal mammary epithelial cells and different breast cancer cells

2.2 CBR3-AS1表达与乳腺癌患者临床病理参数间的关系

依据乳腺癌患者癌组织中CBR3-AS1的表达中位值，将患者分为CBR3-AS1高表达组（43例）和CBR3-AS1低表达组（27例）。统计分析结果显示，乳腺癌CBR3-AS1表达与年龄（P=0.546）、肿瘤大小（P=0.478）和组织学类型（P=0.145）无关，但与TNM分期（P=0.003）、淋巴结转移（P=0.047）和远处转移（P=0.024）有关（表2）。

2.3 CBR3-AS1高表达与乳腺癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析结果显示，CBR3-AS1高表达组3年无瘤生存率和总生存率分别为53.3%和62.8%，CBR3-AS1低表达组3年无瘤生存率和总生存率分别为70.7%和78.4%，CBR3-AS1高表达组3年无瘤生存率（P=0.0032）和总生存率（P=0.0057）均明显低于CBR3-AS1低表达组（图2）。

图2 不同CBR3-AS1表达状态乳腺癌患者的生存曲线 A：无瘤生存曲线；B：总生存曲线Figure2 Survival curves of breast cancer patients witn different CBR3-AS1 expression levels A:Disease-free survival curves；B:Overall survival curves

表2 CBR3-AS1表达与乳腺癌患者临床病理参数间的关系[n（%）]Table2 Relations of CBR3-AS1 expression with clinical variables of the breast cancer patients [n (%)]

2.4 转染效率检测

转染后24 h，阴性对照组CBR3-AS1相对表达量为20.4±2.5，干扰组为2.4±0.3，过表达组为54.3±4.7，过表达组CBR3-AS1相对表达量显著高于阴性对照组（P＜0.01）；干扰组CBR3-AS1相对表达量明显低于阴性对照组（P＜0.01）（图3）。

2.5 CBR3-AS1对乳腺癌细胞增殖的影响

转染后24、48及72 h，细胞活力检测示，过表达组细胞增殖活力明显高于阴性对照组（P＜0.01）；干扰组细胞增殖活力明显低于阴性对照组（P＜0.01）（图4）。

2.6 CBR3-AS1对乳腺癌细胞凋亡的影响

阴性对照组细胞凋亡率为（19.3±1.8）%，干扰组为（53.4±3.2）%，过表达组为（15.2±1.1）%，过表达组细胞凋亡率明显低于阴性对照组（P＜0.01）；干扰组细胞凋亡率明显高于阴性对照组（P＜0.01）（图5）。

图3 qRT-PCR检测转染效率Figure3 Transfection efficiency determination by qRT-PCR

图4 CBR3-AS1对乳腺癌细胞增殖活力的影响Figure4 Influence CBR3-AS1on proliferative viability in breast cancer cells

图5 流式细胞术检测细胞凋亡Figure5 Cell apoptosis measured by flow cytometry

3 讨 论

乳腺癌是发生于乳腺导管上皮的恶性肿瘤，是世界范围内女性常见的肿瘤。2012年，全球乳腺癌新发病例170万例，占所有女性新发癌症的25%，死亡病例52.2万例，占所有女性死亡病例的15%[9-11]。深入研究乳腺癌发病分子机制对寻找乳腺癌新治疗方法和指导预后尤为重要[12-14]。

人类基因组测序显示约98%的基因转录产物不编码蛋白质[15]。lncRNAs是一种新发现的非编码基因，其涉及细胞发育和分化、转录和翻译及代谢调节[16]。越来越多的证据表明lncRNA可作为致癌或肿瘤抑制基因参与多种癌症的发生和进展[17-19]。人乳腺癌中lncRNA的微阵列表达谱分析显示，乳腺癌组织及配对的邻近组织中存在790个上调和637个下调lncRNA[20]。多种lncRNA如POU3F3、MT1DP、HOTAIR和PRNCR1在人类癌症中发挥致癌或抑癌特性[5]。CBR3-AS1，也称为PlncRNA-1，是21号染色体上的蛋白质编码基因，位于羰基还原酶3（CBR3）的反义区域。先前研究[8,21-22]表明CBR3-AS1在前列腺癌和食道癌的癌组织中过度表达且体外调节细胞凋亡和增殖。在骨肉瘤[23]中，CBR3-AS1在癌组织中上调表达，并与Enneking分期、远处转移及组织学分级相关，CBR3-AS1高表达与骨肉瘤预后不良相关，敲低CBR3-AS1表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭，并促进凋亡。吕波等[24]报道lncRNA CBR3-AS1在胆管细胞癌表达升高，升高的lncRNA CBR3-AS1与胆管细胞癌的恶性临床病理特征及患者的不良预后密切相关。在本研究报道了与相应的癌旁组织和细胞系比，CBR3-AS1在乳腺癌组织和细胞系中显著上调，CBR3-AS1高表达与较差的总生存率和无瘤生存率相关。上述结果表明CBR3-AS1可能参与乳腺癌肿瘤进展，并可作为潜在预后标志物。

本研究通过体外功能丧失和功能获得实验揭示CBR3-AS1在乳腺癌肿瘤进展中的作用。在体外，稳定敲低CBR3-AS1可显著抑制乳腺癌细胞增殖活力、诱导乳腺癌细胞凋亡；稳定过表达CBR3-AS1可显著促进乳腺癌细胞增殖、抑制乳腺癌细胞凋亡。研究结果提示CBR3-AS1作为致癌lncRNA在乳腺癌发生和进展中起关键作用。尽管如此，CBR3-AS1靶基因和乳腺癌致癌潜在机制尚不清楚。文献报道lncRNA MALAT1作为miR-1靶标参与调节乳腺癌细胞增殖和凋亡[25]，lncRNA XIST敲低通过上调miR-152抑制人胶质母细胞瘤干细胞肿瘤生长[26]，上述结果提示lncRNA-miRNA功能网络可能在乳腺癌发生发展中起重要作用，如文献报道miR-143调节ERBB3抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭[27]。StarBase v 2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测CBR3-AS1和miR-143之间可能存在结合位点，因而进一步研究CBR3-AS1-miR-143通路对乳腺癌的影响将有助于阐明CBR3-AS1在乳腺癌中发挥致癌作用的分子机制。

总之，本研究发现CBR3-AS1在乳腺癌组织和细胞系中上调，与乳腺癌患者不良预后显著相关。CBR3-AS1作为致癌lncRNA参与调节乳腺癌细胞增殖和细胞凋亡，可能是乳腺癌一种新的预后分子标志物和潜在治疗靶点。