废弃竹笋壳中所提木质素的氧化性研究

刘 娣，张金璟，王亚娟，仇 丹，，邵双喜

（1.宁波工程学院奉化研究院，浙江宁波 315500；2.宁波工程学院材料与化学工程学院，浙江宁波 315211）

近年来，随着经济的快速发展和人们绿色环保意识日益增强，天然环保的木质素及其制品受到越来越多的关注。如Mitjans M等人[1]研究发现，木质素具有抗菌抗诱变等生物活性，尤其是抗氧化活性方面；Li M F等人[2]研究发现，从竹子中提取木质素抗氧化活性比合成抗氧化剂二丁基羟基甲苯（BHT）强，进一步说明天然木质素可以生产抗氧化剂，提高了资源利用率；苏雅静等人[3]对竹笋壳中黄酮类物质的提取工艺优化进行了研究，旨在用提取的黄酮类物质进行清除自由基、防癌、抗衰老等药物保健研究等。醋酸是提取木质素有机溶剂的一种，可在常压下进行，具有对设备要求较低、溶液易挥发、可回收利用等特点，可有效降低提取成本，且提取的木质素具有较低的分子量和较高的反应活性，常用来作为提取的溶剂，通过一系列试验反应进行相关性质研究。

木质素是一种接近无色的物质，木质素的颜色会因为生产方法而改变。木质素溶解度小，分离木质素往往有一定的困难，一般难以进行应用试验研究，故木质素在实际生活中的应用大都将其制成木质素磺酸盐的形式[4]，磺化反应最具实际应用价值，是木质素应用的基础和前提。

对此，试验对提取的木质素基本成分及抗氧化活性进行研究，测定自制木质素磺酸钠、商品木质素磺酸钠、抗坏血酸（维C）3种样品，评价其抗氧化活性，以期为抗氧化剂的进一步研究提供一些依据，同时建立了木质素及其磺酸盐制品对自由基的清除效果的综合评价体系，对提高笋壳高附加值的应用具有实际意义。

1 试验部分

1.1 材料与仪器

笋壳木质素，实验室制备；木质素磺酸钠（95%），市售；水杨酸；对氨基苯磺酸；盐酸萘乙二胺；木质素磺酸钠；Tris HCl；2,2-联苯基-1-苦基肼基；1,4-二氧六环（分析纯），上海麦克林生物化学有限公司提供。

恒温油浴锅，常州国宇仪器制造有限公司产品；超声波清洗机，宁波立城仪器有限公司产品；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；冷冻干燥机、精密电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；高速离心机，上海卢相仪离心机仪器有限公司产品。

1.2 木质素磺酸钠的制备

称取木质素15 mg置于锥形瓶中，加入适量蒸馏水，用移液枪移取90%的醋酸溶液10 mL进行溶解，再加入10 mg无水亚硫酸钠、0.10 mg三氯化铁，混匀静置，用浓NaOH调节溶液pH值至10.5，控制反应体系体积不超过150 mL，磁力搅拌下水浴加热至85℃，持续4 h，冷却过滤，滤液冻干后得到木质素磺酸钠。

1.3 木质素抗氧化活性分析

参照Tao B B等人[5]的方法，DPPH自由基清除能力测定木质素抗氧化能力。用移液枪吸取6组0.1 mL不同质量浓度（0.1~5.0 mg/mL） 木质素溶液（溶解于90%二氧六环），注意不同质量浓度枪头需要更换，加入3.9 mL DPPH溶液（0.06 mmol/L溶于甲醇溶液），在室温下混合后远离光反应30 min。于波长517 nm处用红外分光光度计测定吸光度As，测定空白样吸光度Ab。记录数据按公式（1）计算样品对DPPH自由基清除率（S/%）。

1.4 木质素磺酸钠抗氧化活性分析

1.4.1 清除亚硝酸根离子（NO2-）能力

用移液枪分别吸取5 μg/mL的NaNO2标准液0， 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mL 共 8 组置于比色管，标号1~8，加入1 mL 0.4%对氨基苯磺酸，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，加入蒸馏水至10 mL，以不加标准液的试剂为空白对照，于波长538 nm处测定吸光度，以C（NO2-）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

取1 mL样品溶液（即自制木质素磺酸钠溶液、商品木质素磺酸钠溶液、维C水溶液，其浓度同上，以下样品浓度均为此）置于比色管中，加入0.5 mL 5 μg/mL NaNO2的标准液，加入1 mL 0.4%对氨基苯磺酸，加入0.5 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，加蒸馏水至10 mL，水浴加热15 min，于波长538 nm处测定吸光度。按公式（2）计算清除率。

1.4.2 清除羟基自由基（·OH）能力

用移液枪把浓度为2mmol/L FeSO4溶液1 mL，浓度为2 mmol/L的水杨酸乙醇溶液1 mL加到10 mL比色管中，加入1 mL不同质量浓度的样品溶液，质量分数0.05%H2O21 mL，室温水浴1 h后，于波长536 nm处测定各浓度样品的吸光度A样，以1 mL去离子水代替样品溶液重复上述操作，测吸光度A损，以2 mL去离子水代替H2O2和样品溶液重复上述操作，测定其吸光度A未损。按公式（3）计算清除率。

用移液枪移取2.7 mL Tris-HCl缓冲溶液加入蒸馏水0.1 mL，浓度为30 mmol/L邻苯三酚溶液0.2 mL，混匀后水浴中反应5 min，用浓度为8 mol/L HCl溶液0.1 mL终止反应，于波长318 nm处测定吸光度A0。

移取不同质量浓度的样品溶液0.1 mL各2份，其中一份按上述方法进行，但不加入邻苯三酚溶液测定溶液的吸光度为Ai；另一份代替上述方法中的0.1 mL蒸馏水，测定溶液的吸光度为Aj。按公式（4）计算清除率。

1.4.4 清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力

用移液枪吸取不同质量浓度的样品溶液2 mL，加入2 mL质量浓度为1 mg/mL DPPH·乙醇溶液，于波长518 nm处测定样品溶液的吸光度Ai，取2 mL待测样液与2 mL无水乙醇混合，测定吸光度Aj；取2 mL无水乙醇与2 mL DPPH·乙醇混合，测定吸光度A0[6]。按公式（5） 计算清除率。

1.5 功能性分析

1.5.1 傅氏转换红外线光谱分析（FT-IR）

采用KBr压片法测定，参数设置设备分辨率4cm-1，扫描波数范围500~4 000 cm-1，扫描次数设为32次。取适量样品与一定量的KBr，在玛瑙研钵中混合均匀，将其研成粉末，装到模具上，在压片机上压片，压力不超过8 MPa，持续约1 min后取下，得到的透明薄片在设备上绘制谱图。测试样品为提取出的木质素与木质素磺酸盐。

1.5.2 X射线衍射（XRD）

取适量木质素进行XRD检测，扫描范围10°~90°，扫描方式为连续扫描，调整时间1.50 sec，扫描速率 5°/min，步长 1°。

1.5.3 持油力、持水力及膨胀力测定

称取1.0 g干燥后的样品（提取出的木质素及笋壳粉碎物，下同）加入到50 mL的离心管中，用量筒量取20 mL植物油也加入到离心管中，搅拌均匀后静置1 h，在离心机中离心20 min，弃去上层液体，称质量。按公式（6）计算持油力。

称取1.0 g干燥后的样品加入到50 mL离心管中，用量筒量取20 mL蒸馏水加入到离心管中，放入恒温水浴锅中水浴30 min，冷却20 min，在离心机中离心10 min，弃去上层液体，称质量。按公式（7）计算持水力。

称取1.0 g干燥后的样品放入10 mL量筒中，振荡后记录样品体积。量筒量至10 mL蒸馏水，静置24 h，记录湿粉的体积。按公式（8）计算膨胀力。

式中：m——样品质量，g；

V1——干粉体积，mL；

V2——湿粉的体积，mL。

1.5.4 阳离子交换能力测定

称取样品粉末约0.5 g（木质素及笋壳粉碎物的），浸入浓度为0.1 mol/L的HCl溶液（刚没过粉体表面），混合均匀后静置24 h。将混合液过滤，用蒸馏水冲洗至不含Cl-，用质量分数10%AgNO3溶液检测洗脱液。收集滤渣，于60℃下干燥后称取0.300 g干燥后滤渣，溶解在100 mL 15%NaCl溶液中，用玻璃棒不断机械搅拌5 min，用pH值13的NaOH溶液滴定，直至pH值为7时结束滴定。

2 结果与分析

2.1 木质素及木质素磺酸钠的结构表征

2.1.1 红外光谱图表征分析

商用木质素磺酸钠傅里叶红外光谱图见图1，自制木质素磺酸钠傅里叶红外光谱图见图2。

图1 商用木质素磺酸钠傅里叶红外光谱图

图2 自制木质素磺酸钠傅里叶红外光谱图

在水平数值上对比2组木质素磺酸钠可以看出，它们吸收峰峰值数基本一致，波峰、波谷趋势相近，可初步判断所制木质素磺酸钠为真实的木质素磺酸钠而不是别的其他物质。

对进行醋酸磺化前后的木质素及成品木质素磺酸钠进行红外光谱分析可得出结论，木质素出现强度较高的羟基伸缩振动吸收峰在3 460 cm-1附近，在2 940 cm-1处出现亚甲基C-H伸缩振动吸收峰，1 100 cm-1左右为苯环上磺酸基的振动峰，磺化影响下此处的吸收峰明显减弱，可以说明亚甲基活性受到抑制，无法完整表达出它的活性状态；木质素及木质素磺酸钠在1 625 cm-1显示的是苯环特征吸收光谱，自制木质素磺酸钠在此处吸收峰不太明显。

2.1.2 XRD谱图表征分析

木质素的XRD谱图见图3，木质素磺酸钠的XRD谱图见图4。

由两幅图2θ值对比可看出，木质素的晶型结构与木质素磺酸钠晶型结构基本上没有发生明显的变化，2θ=22.457，说明木质素到木质素磺酸钠的变化，依旧基本上保持了木质素原有的结构。

2.2 木质素清除DPPH自由基性能

由于木质素结构特性，相对分子质量大且缺少亲液性基团，在水和通常溶剂中的溶解性较差，不易溶于水，无法进行持水力和膨胀力的测定，只能进行持油力的测定（之后会做到此试验），无法进行类似木质素磺酸钠的清除自由基能力试验，根据查阅的文献只可以进行木质素清除DPPH自由基的试验[7]。以合成抗氧化剂BHT作阳性对照。

笋壳木质素及BHT对DPPH·清除效果见图5。

图3 木质素的XRD谱图

图4 木质素磺酸钠的XRD谱图

图5 笋壳木质素及BHT对DPPH·的清除效果

IC50是样品自由基清除率达到50%的质量浓度，RSI（radical scavenging index）值为自由基清除指数，数值上等于IC50的倒数。笋壳木质素的RSI值为1.63，显著高于RSI值为0.84的商业合成抗氧化剂BHT，数值越大，抗氧化活性越强，所制得的木质素广泛应用于抗氧化剂的发展市场。

所反映的活性与木质素结构中的羟基、甲氧基、羧基等活性基团有关，尤其是酚羟基的百分比含量，另一方面木质素的不均一性和多分散性的增加则会使木质素自由基反应能力有所降低。因此，根据结论提取的笋壳醋酸木质素可作为天然的抗氧化剂，提供新的抗氧化剂来源，为竹笋及其他应用提供新的方向。

2.3 木质素磺酸钠清除自由基性能

亚硝酸钠标准曲线见图6，对亚硝酸根离子的清除率见图7。

图6 亚硝酸钠标准曲线（R2=0.999 44）

图7 对亚硝酸根离子的清除率

由图7可知，木质素磺酸钠（自制）对亚硝酸根离子的清除率明显比木质素磺酸钠（商用）对亚硝酸根离子的清除率高出很多，也高于维C溶液的清除率，因此木质素磺酸钠（自制）对亚硝酸根具有很好的清除效果。且随着质量浓度的提高，清除率提高，但到一定限度（1 mg/mL）以后，清除效果变化不明显，可粗略估计1 mg/mL是在一定限度内为合适的浓度来清除亚硝酸根离子。

2.3.2 清除羟基自由基（·OH）效果

对羟基自由基的清除率见图8。

图8 对羟基自由基的清除率

由图8可知，木质素磺酸钠（自制）对羟基自由基的清除效果不明显，清除率只有10%左右，随质量浓度变化清除率变化不大，低于维C溶液和木质素磺酸钠（商用）。可知木质素磺酸钠（自制）不适合用来清除羟基自由基。

2.3.3 清除超氧阴离子（O2-）效果

对超氧阴离子自由基的清除率见图9。

图9 对超氧阴离子自由基的清除率

由图9可知，木质素磺酸钠（自制） 对超氧阴离子自由基的清除效果较好，清除率基本可以达到80%左右，清除大部分的超氧阴离子。清除率随质量浓度变化不大，因此较低质量浓度的木质素磺酸钠（自制） 也可以有较好的清除效果。此外，维C水溶液和木质素磺酸钠（商用）都有较好的清除超氧化物阴离子自由基能力，但没木质素磺酸钠（自制）效果明显，木质素磺酸钠（商用）的清除率在0.4 mg/mL左右时和木质素磺酸钠（自制） 相差不大，随质量浓度的提高反而呈现下降反相关的趋势，所以木质素磺酸钠（商用）在低质量浓度时仍有应用价值，但木质素磺酸钠（自制）的效果更好。

2.3.4 清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）效果

对DPPH·的清除率见图10。

图10 对DPPH·的清除率

由图10可看出，3种物质中维C清除DPPH·效果最明显，木质素磺酸钠（自制）对DPPH·也有清除能力，但效果一般且相差不大，而且效果不及维C水溶液。若考虑用作对DPPH·的清除剂，则优先使用维C作为原料，且维C在质量浓度为0.4，1.4 mg/mL时表现出明显优于其余2种清除水平的质量浓度。

2.4 应用性能评价

2.4.1 持油力、持水力、膨胀力效果比较

持油力、持水力、膨胀力效果的比较见表1。

由表1可知，1 g的笋壳粉碎物可以吸附约4.5 g的植物油、6.2 g的蒸馏水，0.1 g的木质素可以吸附约7.5 g的植物油。由此可见，笋壳中的确存在着具有良好吸水吸油的结构，木质素有着优良的持油力，是因为大量不同含氧基团（如酚羟基、羧基和羰基）的存在，使得木质素有相对较低的溶解性，水解木质素的亲水性大大降低了木质素吸附水溶液中有机污染物的能力，通过与含有季胺基的低分子表面活性剂反应，把疏水阳离子引入木质素结构中，这样所得到的改性木质素对有机污染物的吸附能力大大增强，可以用作一种适宜的净水吸附剂。

表1 持油力、持水力、膨胀力效果的比较

2.4.2 阳离子交换能力效果

用计算得到用量0.3 g时所消耗的NaOH的体积算术转换成用量1 g时所消耗NaOH的物质的量来评价阳离子交换能力效果。

阳离子交换能力效果比较见表2。

表2 阳离子交换能力效果比较

由表2可知，1 g笋壳粉碎物所使用的NaOH的量大致0.000 484 3 mol，1 g木质素所使用的NaOH的量为0.000 101 1 mol左右。消耗同等质量情况下，笋壳粉碎物消耗NaOH量远大于木质素，消耗NaOH量越多，说明阳离子交换程度越彻底，也说明了笋壳粉碎物阳离子交换能力更强。

将木质素转为Na+型，配置一定浓度的各种金属盐溶液，可以知道木质素对金属离子的交换吸附容量[8]。木质素中有强烈氢键作用的酚羟基和羧基等活性基团，能形成配位键或氢键，使得其选择吸附性强于一般吸附剂，在实际生产中极性大分子分离方面有较大的实际应用价值。

3 结论

以笋壳为原料提取得到的木质素对DPPH自由基清除指数RSI为1.63，高于商业合成的抗氧化剂BHT（RSI=0.84），具有良好的抗氧化性，既为生产抗氧化剂来源提供了新的原料，又开拓了笋壳应用新的方向。

制备得到的木质素磺酸钠（粗品）与商品木质素磺酸钠（成品）、维C在清除自由基水平相比较，对亚硝酸根离子（）和超氧阴离子自由基（）效果最优，对羟基自由基（·OH）效果最差，对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·） 效果一般，但总的来说笋壳木质素磺酸钠（粗品）对自由基清除均具有较好的能力。