快速直接PCR 检测猪肺炎支原体方法的建立及其应用

徐引弟，张青娴，王治方，焦文强，李海利，朱文豪，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

猪支原体肺炎（Mycoplasmal Pneumonia of Swine,MPS），又称猪地方流行性肺炎（Swine Enzootic Pneumonia），俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体引起的猪的一种慢性呼吸道传染病。主要临诊症状为咳嗽、气喘、呼吸困难、日增重减少、食欲不振，长期生长不良，饲料报酬大幅下降。肺组织的病理变化特征主要是肺的尖叶、心叶、中间叶和隔叶前缘呈肉样或虾肉样实变。本病广泛分布于世界各地，主要为慢性、高接触性、高传染性、高发病率和低死亡率的主要特点。该病常与其他呼吸道病原体如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌或胸膜肺炎放线杆菌等病原协同引起继发性感染肺炎，常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒和猪圆环病毒2 型协同感染引起猪呼吸道病综合征[1-2]。

猪肺炎支原体不但能引起猪地方流行性肺炎，还是猪呼吸道病综合征的一种原发性病原。支原体只要持续存在，就可导致呼吸道疾病的发生，并且也可导致其它疫苗免疫失败。猪支原体病流行于世界各地，不仅在我国存在，在畜牧业发达的美国、澳大利亚等国也普遍存在，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前控制该病的主要措施为疫苗免疫和猪场支原体的净化等手段。

本研究旨在建立猪肺炎支原体快速直接PCR检测方法，用于河南省猪场发生呼吸道疾病的猪肺炎支原体的鉴定，从而为猪肺炎支原体的流行病学、综合防制提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料与参考毒株

病料：2017 年1 月至2018 年12 月在河南省大中型猪场发生重症肺炎呼吸困难、肺发生实变猪的肺脏348 份。阳性对照为猪肺炎支原体168 疫苗株，购自南京天邦生物公司。

1.2 主要试剂和酶

琼脂糖、DL 2 000 Marker、T5 Direct PCR Kit（动物组织）购自擎科生物技术（北京）有限公司。

1.3 PCR 方法的建立

1.3.1 引物的设计 根据GenBank 中猪肺炎支原体16s RNA 基因设计一对通用引物，用于猪肺炎支原体的扩增，由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：上游引物P1：5'-ACGCGTCGACAGAGTTTG ATCCTG-3'，下游引物P2：5'-CGCGGATCCGCTA CCTTGTTACGA-3'，预计扩增目的片段1 600 bp。

1.3.2 模板制备 取适量典型的支原体肺炎的肺组织，碾磨，取1 μL 上清液作为模板。

1.3.3 PCR 检测 PCR 体系为50 μL：2×T5 Direct PCR Mix 25 μL，10 μmol/L P1、P2 各1 μL，模板1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 扩增程序为98 ℃3 min，然后35 个循环：98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃10 s；最后72 ℃5 min；取10 μL 扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.4 PCR 产物的序列分析 将阳性PCR 产物送上海生工生物公司测序，序列用Blast 软件进行比对分析。

1.3.5 特异性试验 将本实验室分离鉴定的猪链球菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌培养，按1.3.3 进行PCR 扩增，电泳观察结果。

1.3.6 敏感性试验 测定DNA 浓度，用无菌去离子水按10 倍浓度梯度分别稀释调整至100～0.001 μg/μL，分别进行扩增。

1.4 PCR 鉴定方法的应用

2017 年1 月至2018 年12 月从河南省及周边省份猪场发生呼吸困难猪的实变肺脏共采集348份，用建立的PCR 方法进行鉴定。

2 试验结果

2.1 猪肺炎支原体PCR 方法的建立

2.1.1 PCR 鉴定 将疑似猪肺炎支原体的肺组织提取DNA，进行扩增，结果如图1 扩增出预期大小符合的片段。阳性片段回收，连接T 载体，测序，比对，序列与168 株同源性均在95%以上。

图1 猪肺炎支原体组织PCR 扩增结果

2.1.2 特异性试验 用PCR 方法对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌进行扩增，结果均未扩增出片段（图2），证明本PCR 方法有较好的特异性。

图2 PCR 特异性试验结果

2.1.3 敏感性试验 敏感性试验结果显示，其PCR检测的灵敏度可达0.1 μg/μL DNA（图3）。对0.01 μg/μL 和0.001 μg/μL 均无扩增，说明该体系扩增下限浓度为0.1 μg/μL。

图3 PCR 敏感性试验

2.2 PCR 方法的应用结果

2017 年1 月至2018 年12 月从河南省猪场发生呼吸困难猪的实变肺脏共采集348 份，用建立的PCR 方法鉴定出猪肺炎支原体226 份阳性，阳性率为64.94%。

3 讨论

猪肺炎支原体可在猪群中持续存在，各种年龄、品种、性别的猪都易感染，该病一年四季都可发生。病猪和隐性带毒猪是主要传染源，无临诊症状有病理变化猪，或无临诊症状无病理变化阴性带菌猪较常见。猪肺炎支原体的诊断方法主要有病原的分离和鉴定，ELISA 方法检测抗体、PCR、原位杂交、芯片检测等。PCR 方法敏感性和特异性较好，是临床病原学诊断中较为普遍的一种方法。病原的分离鉴定是检测病原最为准确、有效的方法，但也是最复杂、最难、最费时间的方法[3-12]。

而常规的PCR 检测操作中，对病变肺组织进行研磨后，猪肺炎支原体的含量极少，因此PCR 方法容易出现假阴性结果，普通PCR 检测方法使用的Taq 酶对极微量的DNA 检出极其困难，极易造成假阴性结果，而本试验中使用的T5 PolStar DNA Polymerase 专为动物组织的直接PCR 扩增而设计，样品可以直接作为模板而无需提取DNA，为针对动物来源模板优化的高保真DNA 聚合酶，具有快速扩增及耐受抑制物的能力，是在具有校正活性的高保真DNA 聚合酶基础上改造而来，融合特殊的DNABinding 结构，使其具有超快的延伸速度，保真度比普通的Taq DNA 聚合酶高20 倍，PCR Mix 中含特异性增强因子SuperPrime 及延伸增强因子Extension Enhancer，可在模板质量不佳或低浓度情况下仍可扩增成功，配合优化的反应缓冲液极大地减少扩增条件的探索，大幅缩短了操作时间，整个过程30 min 内完成。

本研究建立了猪肺炎支原体的快速直接PCR方法，该方法快速敏感准确，阳性率达64%以上，表明猪肺炎支原体在患呼吸道疾病的猪群中感染率较高，是危害猪场的较为普遍、严重的病原。对河南省猪肺炎支原体的病原流行病学研究、疫苗研究、综合防制提供参考。