氟啶胺在大葱和小葱上的残留与安全性评价

朱晓丹，贾春虹，王 东，靖俊杰，贺 敏*

（北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097）

氟啶胺是日本石原产业自主研发生产的2,6-二硝基苯胺类低毒、广谱性杀菌剂，对蔬菜及果树上的许多病害都有一定的防治效果[1-3]。氟啶胺对疫病有特效，很多登记产品用于防治辣椒疫病、马铃薯和番茄晚疫病等[4-8]。葱是我国传统的调味品蔬菜，在我国属于小作物[9-10]。近些年随着市场需要，葱的种植面积不断扩大，且复种指数增加，其病害发生情况逐年加重[11-13]。氟啶胺已广泛用于葱疫病的防治，但目前氟啶胺并未在葱上登记使用[14]，且无食品安全限量标准指导生产和安全监管，亟需开展氟啶胺在葱上的残留试验，制定氟啶胺在葱上的食品安全限量标准，保障农产品安全和进出口贸易[15]。

关于氟啶胺的残留与消解行为研究，国内外已见报道的作物有辣椒、马铃薯、人参等[16-20]，其在不同作物上的残留量差异较大。目前国内外鲜见氟啶胺在大葱或小葱上的残留报道。国内外报道的关于氟啶胺的检测分析方法有气相色谱法[21-23]、液相色谱法[24-25]、液相色谱-质谱联用法[26-28]，涉及的基质有蔬菜、水果和粮食作物，但鲜有涉及大葱或小葱。因此，本试验开展氟啶胺在大葱和小葱上的残留分析方法研究，并开展氟啶胺39.5%（体积分数）悬浮剂在大葱和小葱上的消解动态和最终残留试验，本研究结果可为氟啶胺在大葱和小葱上的安全合理使用技术、膳食摄入风险评估和食品安全限量标准的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验地点和葱品种：北京市顺义区木林镇荣各庄村的试验葱品种为‘北京高脚白’；山东省淄博市周村区南郊镇柳行村的试验葱品种为‘章丘大葱’；内蒙古乌兰察布市凉城县麦胡图镇麦胜七队的试验葱品种为‘春葱一号’；江苏省南京市溧水区百马镇江苏省农科院试验基地的试验葱品种为‘小香葱’；四川省彭州市濛阳镇四川省农科院植物高技术育种试验基地的试验葱品种为小葱；浙江省杭州市余杭区仓前镇羊锅林的试验葱品种为‘四季小葱’。

甲酸（色谱纯，纯度89.5%）、氟啶胺标准品（纯度99.6%） 百灵威科技有限公司；乙腈（色谱纯，纯度大于99.9%） 美国赛默飞世尔公司；氟啶胺39.5%（500 g/L）悬浮剂 日本石原产业株式会社；纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司；0.22 µm滤膜 美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

Acquity-Xevo TQD超高效液相色谱-三重四极杆质谱（配备MassLynx V 4.1数据采集和处理系统）、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm） 美国Waters公司；2 mL净化剂管（内装有无水硫酸镁150 mg、N-丙基乙二胺50 mg、石墨化炭黑50 mg、十八烷基碳50 mg） 天津博纳艾杰尔科技有限公司；2094样品均质机 丹麦FOSS公司；1/100 000和1/100电子天平 瑞士梅特勒-托利多集团；UMV-2多管漩涡混合器 北京优晟联合科技有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机、H1650-W高速离心机湖南湘仪仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田间试验

于2017年进行试验。试验设计参照NY/T 788—2004《农药残留试验准则》[29]进行，分为最终残留试验和消解动态试验2 个部分。试验均设空白对照区、高剂量试验区、低剂量试验区、消解动态试验区。采样方法、样品制备、贮存等按照《农药登记残留田间试验标准操作规程》[30]执行。

1.3.2 消解动态试验

消解动态试验仅在山东和四川两地进行。动态试验小区面积50 m2，另设清水喷雾对照区，各处理间设保护隔离区。于葱苗长至20 cm高时开始施药，施药剂量为375 g/hm2（以有效成分计，下同），兑水喷雾葱全株，每亩用水量约30～50 L，分别于施药后1 h和1、3、7、14、21、28、35 d采用随机的方法在试验小区内采集样品。小区边行和每行距离两端0.5 m内不采样。

1.3.3 最终残留试验

设两个施药剂量：低剂量（250 g/hm2）和高剂量（375 g/hm2）。各设2 次施药和3 次施药两个处理，每个处理设3 次重复，每小区15 m2。按照试验设计时间开始第1次施药，施药间隔期为7 d。采样时间为距离最后一次施药间隔5、7、10、14 d。另设清水空白对照，各处理间设保护带。

1.3.4 样品采集、制备与保存方法

采用随机的方法在试验小区内10 个以上的采样点采集不少于1.0 kg的大葱或小葱样品，装入样本容器中包扎妥当，带回实验室及时处理。样品用不锈钢刀切成1 cm左右的碎块，在不锈钢盆里充分混匀，四分法分取150～200 g样品两份，分别装入封口样品容器中，贴上标签后于冰柜内－20 ℃低温保存，待用。

1.3.5 氟啶胺含量的分析

1.3.5.1 样品的前处理

提取：称取样品10 g（准确至0.01 g）置于50 mL聚四氟乙烯试管中，加入20 mL乙腈溶液，漩涡振荡提取3 min，再加入3.0 g氯化钠，漩涡振荡1 min，4 000 r/min离心5 min，待净化。

净化：将1.5 mL提取液转入2 mL分散净化管中，漩涡振荡1 min，离心1 min，上清液过0.22 µm滤膜后，转入预切口进样小瓶待分析。

1.3.5.2 检测条件

液相色谱条件：Acquity UPLC BEH C18不锈钢柱，柱温35 ℃，样品室温度15 ℃，进样量3.0 µL。流动相A为体积分数0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3 µL/min。流动相梯度洗脱程序：0～3 min，流动相A由90%线性变化至10%；3～4 min，流动相A保持10%；4～5 min，流动相A由10%线性变化至90%。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子电离，毛细管电压3.20 kV，离子源温度150 ℃，去溶剂温度400 ℃；去溶剂气和锥孔气均为高纯液氮，去溶剂气流速为700 L/h，锥孔气流速为50 L/h；碰撞气为高纯氩气；采用多反应离子对监测模式，以定量离子对、定性离子对和保留时间进行定性，以峰形好、干扰小、响应高的定量离子对进行定量。氟啶胺的定量离子对、定性离子对、锥孔电压、碰撞电压、保留时间见表1。

表 1 检测氟啶胺的超高效液相色谱-串联质谱参数Table 1 UPLC-MS-MS conditions for fluazinam

1.3.5.3 标准曲线和添加回收率测定

取200 µL 1 000 mg/L氟啶胺母液，用乙腈定容到20 mL，配制成质量浓度为5.0 mg/L的标准溶液。用系列稀释法配制质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的标准曲线系列。

取空白大葱或小葱样品，按照1.3.5.1节方法进行试验，净化后的样品为大葱或小葱基质。用净化后的大葱或小葱基质稀释氟啶胺母液，配制成质量浓度为5 mg/L的标准溶液作为母液，用系列稀释法配制质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的大葱或小葱基质标准曲线。

添加回收率测定：称取空白大葱和小葱样品，添加一定量的氟啶胺标准溶液，设定0.01、0.05、0.5 mg/kg 3 个添加量，每个添加量设置5 个重复，另设空白对照样品（不添加氟啶胺）。

1.3.5.4 定量分析

本研究中检测限（limit of detection，LOD）按照3 倍信噪比计算。

采用外标法定量，即用氟啶胺标准品（加入一定量的基质）配成一系列标准溶液，以氟啶胺标准溶液质量浓度为横坐标，定量离子对的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线y＝ax＋b，其中y为定量离子对的色谱峰面积，x为氟啶胺标准溶液质量浓度，a为直线斜率，b为直线截距。本试验中采集的大葱或小葱样品的氟啶胺残留量按式（1）计算。

式中：C表示氟啶胺残留量/（mg/kg）；V为提取溶液体积/mL；m为样品质量/g。

基质效应系数（matrix effects，ME）按式（2）计算。

式中：B表示基质标准曲线的斜率；A表示溶剂标准曲线的斜率。当|ME|＜10%时，基质效应可以忽略，用溶剂标准曲线定量即可；当10%＜|ME|＜50%时，有基质效应增强或减弱现象，用基质标准曲线定量可适当消除基质效应对定量结果的影响；当|ME|＞50%时，基质效应对定量的干扰较大，应优化样品预处理方法使|ME|＜50%。

农药的消解趋势用一级反应动力学方程（式（3））计算。

式中：Ct表示时间t时的农药残留量/（mg/kg）；Co表示施药后作物上的原始沉积量/（mg/kg）；k表示消解系数；t表示施药后时间/d。

半衰期（t1/2）表示农药残留量消解一半所需要的时间，按式（4）计算。

1.4 数据分析

采用Excel软件进行数据处理与作图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与基质效应

表 2 氟啶胺在不同基质中的线性方程、相关系数、ME和LODTable 2 Calibration equations, correlation coefficients, ME and LOD for fluazinam in different substrates

如表2所示，氟啶胺在0.002～0.5 mg/L范围内能均呈现出很好的线性关系，相关系数大于0.999。氟啶胺在大葱和小葱基质中的ME分别为2.5%和6.2%，均小于10%，说明基质效应可以忽略，用溶剂标准曲线定量即可。

2.2 定量分析方法的准确度、灵敏度和精密度

表 3 氟啶胺在大葱和小葱中的添加回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of fluazinam spiked into green Chinese onion and shallot

氟啶胺在大葱和小葱中的添加量分别为0.01、0.05、0.5 mg/kg时，回收率数据如表3所示。结果表明，氟啶胺在大葱中的回收率为81.4%～107.0%之间，相对标准偏差为2.7%～4.6%；氟啶胺在小葱中的回收率为99.0%～111.1%之间，相对标准偏差为1.5%～3.1%，满足农药残留分析的要求。

2.3 氟啶胺在大葱和小葱上的消解动态分析结果

图 1 氟啶胺在大葱（A）和小葱（B）上的消解曲线Fig. 1 Degradation curves of fluazinam in green Chinese onion (A) and shallot (B)

如图1所示，氟啶胺在山东大葱上的原始沉积量为1.313 mg/kg，其消解规律符合一级动力学模型，消解方程为C＝2.286 8e－0.593t，相关系数r＝0.956 6，7 d消解率约为96.1%，半衰期t1/2＝1.2 d。氟啶胺在四川小葱上的原始沉积量为3.265 mg/kg，其消解规律符合一级动力学模型，消解方程为C＝3.587 3e－0.08t，相关系数r＝0.977 9，35 d消解率约为94.4%，半衰期t1/2＝8.7 d。

氟啶胺39.5%悬浮剂喷雾在大葱和小葱上原始沉积量和降解半衰期差异明显，大葱上的原始沉积量远小于小葱，且在大葱上降解比在小葱快，这主要与大葱和小葱地上部分生物量不同有关[31-32]。

2.4 氟啶胺在大葱和小葱中的最终残留量分析结果

于北京、山东、内蒙古试验点共采集144 个大葱样品，江苏、四川、浙江试验点共采集144 个小葱样品（不包括空白样品），氟啶胺在大葱和小葱上的最终残留情况见表4。

表 4 氟啶胺在大葱和小葱上的最终残留量Table 4 Final residues of fluazinam in Chinese green onion and shallot

北京、山东和内蒙古的所有大葱样品氟啶胺最终残留量为＜0.010～0.400 mg/kg，采收间隔期5、7、10、14 d时，其最高残留量分别为0.308、0.400、0.118、0.045 mg/kg，残留量中值分别为0.139、0.068、0.012、0.015 mg/kg。江苏、四川和宁夏的所有小葱样品氟啶胺最终残留量为0.100～5.738 mg/kg，采收间隔期5、7、10、14 d时，其最高残留量分别为5.738、5.018、3.334、4.909 mg/kg，残留量中值分别为3.347、2.006、1.502、1.030 mg/kg。

本试验中，氟啶胺在大葱上使用后的残留量远低于小葱，与氟啶胺在大葱和小葱上的消解趋势基本吻合。大葱的植株个体大、生长快、生物稀释作用强。等量的氟啶胺喷雾到大葱上后，其在大葱上的原始沉积量低于小葱，多次施药后，其最终残留量比小葱低。理论上，随着施药次数增多、施药量增加、采收间隔期缩短，大葱和小葱上氟啶胺的残留浓度会逐渐增加[33]。但是在葱的种植过程中，因为葱的品种、植株大小、种植地的气候条件、土壤质地、有机质含量、微生物群落等差异，导致不同试验地点的样品中氟啶胺的残留量不同，且其残留量的增减规律与理论值有一定差距，符合农业生产的实际情况[34-35]。

欧盟、日本、韩国规定氟啶胺在葱上的最大残留限量分别为0.01、0.1、3.0 mg/kg，中国、国际食品法典委员会、美国、加拿大和澳大利亚均未规定氟啶胺在葱上的食品安全限量标准。参照韩国的限量标准，采收间隔为14 d时，氟啶胺在大葱上的残留量是安全的，江苏和四川收获的小葱样品中氟啶胺的残留量是安全的，但是宁夏的小葱样品中氟啶胺的残留量高于3.0 mg/kg，食用不安全。参照欧盟的限量标准，我国大葱和小葱上氟啶胺的残留都不安全。参照日本的限量标准，大部分大葱和小葱样品中氟啶胺的残留都不安全。大葱和小葱是我国传统的调味品蔬菜，在日常烹饪中经常会用到，但是它们作为膳食的摄入量并不大，完全依据国外的限量标准评判氟啶胺在大葱和小葱上的残留安全性可能并不合适[36]，我国应加快制定氟啶胺在大葱和小葱上的残留限量标准，保障食品安全。

3 结 论

本研究建立了氟啶胺在大葱和小葱上的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，方法的灵敏度、准确度、精密度符合农药残留分析的要求。开展了氟啶胺39.5%悬浮剂在大葱和小葱上的消解动态和最终残留试验，结果表明，氟啶胺在大葱和小葱上的消解速度很快，降解半衰期分别为1.2 d和8.7 d。低剂量（250 g/hm2）和高剂量（375 g/hm2）施药2～3 次，施药间隔7 d，采收间隔期5、7、10、14 d时，收获的大葱中氟啶胺的残留量为＜0.010～0.308 mg/kg，小葱中氟啶胺的残留量为0.100～5.738 mg/kg。我国未制定氟啶胺在大葱和小葱上的食品安全限量标准，欧盟、日本、韩国规定氟啶胺在葱上的限量标准分别为0.01、0.1、3.0 mg/kg。根据本试验结果，参照国外的限量标准评判氟啶胺在大葱和小葱上的残留安全性过于严格，我国应加快制定氟啶胺在大葱和小葱上的残留限量标准。