基于近红外光谱结合代谢流分析的L-缬氨酸发酵过程监控

魏洪波 石 拓 崔 毅 张权威 杜丽红 陈启欣 谢希贤，2，3 陈 宁，2，3，4*

（1 天津科技大学生物工程学院 天津300457 2 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室 天津300457 3 中国轻工业微生物工程重点实验室 天津300457 4 天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心 天津300457）

L-缬氨酸作为必需氨基酸之一，在医药、食品添加等方面用途十分广泛。从饲料添加剂、食品添加剂等到多肽类药物缬氨酸霉素的合成和复合氨基酸的配制，L-缬氨酸的需求越来越大，工业应用对L-缬氨酸产品质量的要求越来越高。实时监控L-缬氨酸发酵过程，保证发酵的顺利进行就显得尤为重要。L-缬氨酸发酵过程中，pH、温度、溶氧和搅拌转速等因素都会对细胞代谢产生影响[1-4]，而菌体细胞的代谢变化也会影响发酵产物转化率和利用率。对于细胞内部微观代谢流变化的计算方法主要为代谢流分析（Metabolic flux analysis）。代谢流分析是一种通过建立细胞内部代谢物合成与消耗的代谢模型，计算细胞内部代谢流量分布的技术[5-7]。利用代谢流分析技术能更好地了解细胞代谢情况，及时对发酵条件作出调整，提高发酵产物转化率和利用率。

导致代谢流分析无法快速实时应用到发酵过程监控的主要原因在于对发酵过程中代谢产物组分的检测方法较为复杂。发酵过程中代谢产物的传统检测方法主要包括：氨基酸分析仪检测、液相色谱分析与气相色谱分析以及生物信息传感器等。这些方法不仅对样品的要求较高（很多需要衍生处理，样品处理不达标往往无法准确测出样品参数，同时对仪器造成一定损伤），而且对于样品的分析时间长，无法满足对发酵过程中组分的实时定量，因而无法快速地带入代谢流模型中进行代谢流分析计算，从而不能够及时对发酵条件作出调整，影响发酵效果，增加发酵失败的几率[8-10]。近红外光谱分析系统可以结合多元校正模型，实现对多组分的同时测定，而且分析时对发酵样品无损伤，能够实现快速、准确、安全的检测。

发酵过程传统的控制方法，主要是根据发酵过程控制器参数的变化来调整发酵控制的条件。这种方法缺乏对细胞内部状态的分析监测，同时由于控制器或电极等硬件出现不灵敏或损坏等问题，导致发酵过程控制不及时、不正确等问题，无法实时准确地监测发酵过程。利用近红外光谱结合代谢流模型可以快速、准确地分析L-缬氨酸发酵过程代谢流分布，不仅弥补了传统检测方法对于代谢物浓度检测的不足，还可以实现对多组分快速准确的同时测定，快速分析发酵过程中细胞内部的代谢流分布，从而实时准确监控整个发酵过程，为L-缬氨酸发酵过程自动化控制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

Antaris II 近红外分析仪，ThermoFisher Scientific 公 司；TQ Analyst 光谱分析软件，ThermoFisher Scientific 公司；OPUS 7.0 近红外分析软件，德国Bruker 仪器公司；高效液相色谱，日本岛津公司（SHIMADZU，LC-20AT）。

1.2 菌种

L-缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌 （C.glutamicum）XV，由天津科技大学生物工程学院代谢工程实验室选育并保藏。中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏编号CGMCC No.1.15672。

1.3 培养基

1.3.1 斜面培养基 葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂25 g/L，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min，pH 7.0～7.2。

1.3.2 种子培养基 玉米浆10 mL/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖30 g/L，豆粕水解液10 mL/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeSO4·H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH0.1 mg/L，L-Met 0.6 g/L，L-leu 0.2 g/L，L-Ile 0.2 g/L，味精10 g/L。

1.3.3 发酵培养基 玉米浆30 mL/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖80 g/L，豆粕水解液20 mL/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，FeSO4·H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH10 mg/L，L-Met 0.5 g/L，L-leu 0.2 g/L，L-Ile 0.2 g/L，味精10 g/L。

1.4 发酵条件

1.4.1 种子培养条件 将活化好的缬氨酸生产菌在超净台中划取一定量到种子液体培养基中，液体总量为1 500 mL，平均置于5 个三角瓶中，用12 层纱布封口，培养温度32 ℃，培养时间14 h。

1.4.2 发酵培养条件 发酵培养采用30 L 发酵罐进行，将1 500 mL 种子培养基接入罐中，发酵温度维持在32 ℃，发酵周期38～42 h。在整个发酵过程中控制pH 值在7.0 上、下波动。做两批发酵试验，发酵条件均相同。当菌体到达产酸期时，分别将溶氧控制在20%和10%，以保证样品的多样性和代表性。

1.5 L-缬氨酸发酵过程各组分浓度近红外模型的建立[11]

1.5.1 近红外模型建立步骤 L-缬氨酸发酵过程各组分浓度近红外模型建立步骤：1） 建模所需样品的选择 选择一个能够平均分布且能代表整个总体的样本集合；2） 原始近红外光谱的获得 将发酵液样品放入近红外扫描仪扫描获得原始近红外光谱；3） 原始光谱预处理 利用近红外分析软件选择合适的光谱预处理条件对原始近红外光谱进行处理，以减少噪声等因素的影响；4）近红外模型的建立 利用偏最小二乘的方法建立近红外模型；5） 对建立的模型进行验证。

1.5.2 近红外模型的建立 利用近红外扫描仪在波数范围4 000·10 000 cm-1处采集发酵液近红外光谱。采集时将发酵液倒入2 mm 的石英比色皿中，放入近红外扫描仪中扫描。通常情况下每次扫描样品前需进行背景采集。将采集的光谱利用近红外软件分析，并与样品的化学值一一对应，用近红外软件优化后建立近红外模型。

1.6 L-缬氨酸代谢流分析模型的建立[12-14]

根据发酵液中测定的氨基酸和有机酸，建立L-缬氨酸发酵过程的代谢网络模型。建立原则：1）忽略稳定期的细胞浓度变化；2） NADPH 供需平衡，即消耗的NADPH 与产生的NADPH 相等；3）由于存在大量“无效”循环，因此不考虑ATP 总量的平衡；4） 无分支点的中间反应及按照固定比例进行的反应可简化为一个反应方程。

2 结果与讨论

近红外光谱结合代谢流分析快速检测L-缬氨酸发酵过程的代谢流分布方法的原理如图1所示。为了更好地监控L-缬氨酸发酵过程，从L-缬氨酸生产菌发酵过程出发，利用近红外光谱结合代谢流分析技术，建立一种快速分析L-缬氨酸发酵过程细胞内部代谢状态的方法。该方法只需通过对L-缬氨酸发酵液进行近红外扫描，带入建立好的近红外及代谢流模型，通过分析计算快速、准确地反映细胞代谢状态，根据细胞代谢状态快速控制及调整发酵条件，达到实时监控L-缬氨酸发酵过程的目的。

图1 近红外光谱结合代谢流分析实时监测L-缬氨酸发酵过程原理Fig.1 The principle of NIR combined with metabolic flux model to monitoring the L-valine fermentation process in real time

2.1 L-缬氨酸原始近红外光谱

图2为L-缬氨酸发酵过程中发酵液样品的原始近红外光谱图。从整个样品集的峰型来看，样品峰型比较集中。由于在5 000～6 500 cm-1波数范围光谱峰型较规则，因此首选此波长范围建立校正模型。

2.2 L-缬氨酸发酵液中各组分浓度近红外模型

2.2.1 样品的划分 在发酵过程共收集180 个发酵液样品，其中校正集144 个，检验集36 个。两者浓度范围、平均数和标准差如表1所示。从浓度范围看，模型校正集与外部检验集的浓度范围在模型建立要求范围。从平均数和标准差的数值来看，模型校正集和外部检验集的数值差别较小，说明样品间的差异较小，有利于建立模型。

图2 L-缬氨酸发酵样品的近红外光谱Fig.2 NIR spectra of samples of L-valine fermentation

表1 发酵液中主要产物浓度参数Table 1 Parameters of main products concentration in the fermentation broth samples

2.2.2 L-缬氨酸发酵液各组分浓度校正模型 利用近红外软件自动优化的功能，对发酵液样品原始近红外光谱进行自动优化，结果见表2。优化的波数范围为5 000～6 550 cm-1。在此波数范围比较几种光谱预处理方法的优劣。其决定因素主要为RMSECV 值，通常选择RMSECV 值最小的光谱预处理方法作为最优方法，同时兼顾RPD 及决定系数（R2）的影响。

表2 L-缬氨酸发酵近红外模型自动优化后5 000～6 550 cm-1 范围不同光谱预处理方法结果比较Table 2 Comparison of different spectral pretreatment methods after automatic optimization in L-valine concentration model at 5 000-6 550 cm-1

从表2参数可以看出，在波数5 000～6 550 cm-1范围，比较几种预处理方法的优劣，根据近红外软件优化结果，得出L-缬氨酸、葡萄糖、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸和乳酸的近红外浓度最优模型。其中各物质决定系数R2均大于0.9，说明模型具有较好的准确性。

L-缬氨酸发酵过程主要产物浓度模型RMSECV 与维数关系如图3所示。维数主要影响模型的拟合度，维数过少使模型的拟合度降低，而维数过多则易出现过拟合现象。可以看出，各模型维数均在7～9 之间，此时RMSECV 值均为最小或接近最小。

图3 L-缬氨酸发酵主要产物浓度模型RMSECV 与维数关系Fig.3 RMSECV versus the numbers of latent variables in the model of main products concentration in L-valine fermentation

对上述建立的各组分模型进行交叉检验，如图4所示，反映发酵样品中校正集各组分浓度的实际值和预测值关系；图5所示检验集各组分浓度的实际值和预测值关系。

图4 校正集中L-缬氨酸发酵主要产物浓度实际值与预测值的关系Fig.4 Predicted values versus experimental values based on the calibration set and of main products concentration in L-valine fermentation

图5 检验正集中L-缬氨酸发酵主要产物浓度实际值与预测值的关系Fig.5 Predicted values versus experimental values based on the validation set and of main products concentration in L-valine fermentation

从图4和图5可以看出，各模型校正集与检验集中产物浓度实际值与预测值线性关系较好，样品均匀分布在标准曲线的两侧，异常样品或误差较大样品已被剔除。结合表2各物质浓度模型参数，表明所建各产物浓度模型均具有良好的预测能力。

2.3 L-缬氨酸合成途径的代谢流分析

2.3.1 构建代谢网络模型 根据L-缬氨酸合成途径中各步酶促反应的化学计量平衡式和各代谢节点处的化合物平衡关系[15-17]，建立L-缬氨酸生物合成的简化代谢网络图6。

通过对L-缬氨酸发酵代谢网络简图及反应速率方程组的分析，只要得到4 种代谢物的反应速率，就可将其化学值带入反应速率方程组中求解。通过计算得出每个代谢物的代谢流量。通过上述建立的近红外校正模型，可快速、准确测定表3中4 种代谢物的浓度，通过计算得到各物质的反应速率。

2.3.2 L-缬氨酸合成的代谢流量计算 通过上述分析可知，只要得到4 种代谢物的反应速率，就可得出通过每个代谢物的代谢流量。两批平行发酵试验，前期菌体生长时发酵条件控制一致，在24～34 h 菌体产酸期，将发酵过程的溶氧分别控制在10%和20%。通过采集不同溶氧条件下的发酵液，并扫描得到对应近红外光谱，代入上述近红外校正模型，即可快速、准确的测定其中4 种代谢产物的浓度。利用上述方法测定不同时间4 种代谢产物浓度，即可计算出表3中不同溶氧条件下4 种代谢产物积累或消耗速率。

表3 发酵中、后期代谢产物变化速率及代谢流量Table 3 Variation rate and metabolic flux of metabolites during the middle and late period

L-缬氨酸发酵产酸期的代谢流分布利用MATLAB 软件线性规划并计算得到，结果见图7。图中数值为20%溶氧条件下通过各代谢节点的代谢流量，其中“（·）”中的数值为10%溶氧条件下通过各代谢节点的代谢流量。

图6 L-缬氨酸生物合成代谢网络简图Fig.6 Stoichiometric model of L-valine biosynthesis

图7所示，在发酵条件溶氧控制为20%时，L-缬氨酸发酵代谢流第1 步反应的代谢流量为100，说明此时葡萄糖的消耗较快，而代谢产物乳酸的代谢流量值6.49，其合成的速率比较慢。此时代谢流量主要集中在TCA 循环，菌体获得大量的能量来维持自身细胞生长；当溶氧条件控制在10%时，相比于溶氧20%的条件下，虽然葡萄糖的消耗速率没有明显的变化，但是通过乳酸的代谢流量为8.83，明显高于20%溶氧条件下的6.49，说明此时乳酸积累速率加快，菌体维持自身生长代谢所需能量通过无氧呼吸来提供。发酵过程中为了避免乳酸的大量积累，此时应采取提高溶氧的发酵控制措施。综上，采用近红外光谱分析结合代谢流分析，能够及时获取胞内代谢流分布的数据，快速、准确地了解发酵过程菌体内部的代谢状态，从而实时监测发酵动态，及时调整发酵条件，确保发酵过程的顺利进行。

图7 发酵产酸期L-缬氨酸合成的代谢流分布Fig.7 The flux distribution of L-valine biosynthesis during acid producing period

3 结论

利用近红外光谱分析技术结合偏最小二乘（PLS）的方法构建了L-缬氨酸发酵过程中几种主要代谢原料及代谢产物物浓度预测模型。通过对原始近红外光谱的分析预处理，以及对模型的优化，结果表明所建模型预测能力良好。结合代谢流模型对不同发酵条件下L-缬氨酸合成的代谢途径进行分析，计算出不同溶氧条件下的代谢流分布。可以快速得到并分析出L-缬氨酸发酵过程中通过EMP、HMP 和TCA 等重要节点或产物的代谢流量，并及时调整发酵条件。综上，通过近红外光谱分析技术结合代谢流模型能够快速地对L-缬氨酸发酵过程中的代谢流分布作出准确分析，及时检测到细胞内部的微观代谢流量变化。本方法能够较好地预测和监控发酵过程。