HPLC法同时测定多效防护霜中盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯的含量

韩 凌，王新霞，吕 磊，张静如，阚月一，鲁 莹，傅 翔

(1.上海控江医院药剂科，上海 200093；2.上海东方肝胆外科医院药材科，上海 200438；3.海军军医大学药学院，上海 200433)

随着我国开发海洋战略的加速实施，部队海上训练和驻岛守礁的任务日益繁重，长远航已成为我海军维护国家海洋权益、彰显维护世界和平责任的常规军事任务，任务执行过程中，有毒海洋生物蛰伤和紫外线灼伤是减少非战斗减员，提高军事作业能力亟待解决的问题[1-2]。本研究根据课题组的前期基础(高原防晒产品列装高原部队使用多年)，设计包括抑制刺丝囊发射的预防成分、舒缓蜇伤后局部症状的治疗成分以及抗紫外线成分组成的兼具防护有毒海洋生物蜇伤和紫外线灼伤的多效防护霜[3-5]。该制剂可填补我海军卫勤保障军特药品种的空白，极大促进我军海上卫勤保障实力。

多效防护霜采用环戊硅氧烷、氢化蓖麻油、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯、氧化锌、二氧化钛、盐酸苯海拉明等成分制备而成，采用特殊处方工艺，确保防蛰伤成分和防晒剂成分在高湿及海水浸泡条件下维持有效浓度2 h以上，抗紫外线灼伤能力可靠(SPF值达到30)，可防水浸泡与冲刷。处方中盐酸苯海拉明是防止有毒海洋生物蜇伤的成分之一，而甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯作为防晒剂是对抗紫外线的成分。本研究选择多效防护霜中的3种药效成分，采用HPLC法进行同时测定[6-8]，以期为制剂的质量标准研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Scientific U3000系列高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔公司)，配有四元泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器；分析软件为Chromeleon工作站。AL-104电子天平(瑞士梅特勒公司)；DL-360A超声发生器(上海之信仪器有限公司)； VORTEX-6涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器有限公司)；Barnstead D3750超级纯水仪(美国赛默飞世尔公司)。

1.2 药品与试剂

对照品盐酸苯海拉明(批号：100066-200807)购自中国食品药品检定研究院、二苯酮(批号：H179Z67919)购自鼎瑞化工有限公司、甲氧基肉桂酸辛酯(批号：PHR1080)、水杨酸辛酯(批号：PHR1081)购自Sigma公司(纯度>98.0%)，乙腈和甲纯为色谱纯(Sigma公司，USA)，其余试剂均为分析纯，水为纯水。3批多效防护霜批号分别为20180726、20181129、20181205，均为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取盐酸苯海拉明、二苯酮、甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯对照品20.08、20.10、100.04、100.03 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为2008.00、2010.00、10004.00、10003.00 μg/ml的对照品储备液，其中二苯酮仅用于专属性实验。将其余3种储备液各取0.5、1.0、1.0 ml，定容至10 ml量瓶中，并按1、2、5、10、15、20的比例逐级稀释，即得系列浓度的混合对照品溶液，浓度分别为：盐酸苯海拉明：5.02、10.04、25.10、50.20、75.30、100.40 μg/ml；甲氧基肉桂酸辛酯：50.02、100.04、250.10、500.20、750.30、1000.40 μg/ml；水杨酸辛酯：50.02、100.03、250.08、500.15、750.23、1000.30 μg/ml，置于4℃冰箱保存。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取多效防护霜1.0 g，置50 ml量瓶中，加入甲醇约35 ml，超声20 min至完全破乳溶解(功率240 W，频率40 kHz)，甲醇定容至50 ml，摇匀；取初提液1 ml，加乙腈1 ml，涡旋30 s，13 000 r/min离心5 min，取上清即得样品溶液。置4℃冰箱密封，避光保存。

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-乙酸铵缓冲溶液(B，20 mM，pH = 7.5)，梯度洗脱，A相比例随时间变化为：0～10 min、A→60%；10～12 min、A 60%→92%；12～20 min、A→92%，采集时间20 min，平衡时间10 min，流速：1 ml/min；紫外检测波长：218 nm；柱温：25℃；进样量：15 μl；外标法定量。

2.4 方法学验证

2.4.1系统适用性试验

按出峰顺序，盐酸苯海拉明、二苯酮、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯的保留时间分别为：5.7、9.7、17.3、18.5 min。根据色谱图中4个峰的相关参数计算系统适用性，其理论塔板数均>3 000，相邻峰的分离度均>1.5，脱尾因子在0.9～1.1的范围内。盐酸苯海拉明的降解产物二苯酮不干扰其出峰。空白基质、对照品以及样品的色谱图见图1。

2.4.2线性关系

将“2.1”项下制备的系列混合对照品溶液按“2.3”项下色谱条件依次连续进样，分别重复3次，以对照品溶液浓度(X,μg/ml)对峰面积(Y)进行线性回归，呈良好的线性关系，见表1。

2.4.3定量限和检测限

将3种对照品溶液进行逐级稀释，以信噪比10∶1，确定其最低定量限；以信噪比3∶1，确定其最低检测限。盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯的最低定量限分别为2.5、1.0、1.0 μg/ml；最低检测限分别为1.0、0.4、0.4 μg/ml。

2.4.4精密度试验

取“2.1”项下制备的混合对照品溶液中的第2、3、5三个点作为低、中、高3个浓度点，在1 d以内连续进样3次，以及连续3 d分别进样，根据所得峰面积分别考察日内和日间精密度。结果盐酸苯海拉明的日内和日间精密度RSD均 < 3.0%，甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯的日内和日间精密度RSD均 < 2.0%，表明本方法的精密度良好。

图1 多效防护霜的HPLC图 A.对照品；B.供试品；C阴性对照：1.盐酸苯海拉明；2.二苯酮；3.甲氧基肉桂酸辛酯；4.水杨酸辛酯

待测成分回归方程线性范围(μg/ml)r盐酸苯海拉明Y= 0.394 1X -0.26995～1000.999 9甲氧基肉桂酸辛酯Y=0.382 2X+0.939 250～1 0000.999 9水杨酸辛酯Y=0.2351X+6.105 150～1 0000.999 5

2.4.5重复性试验

精密称取同一批次样品1.0 g(批号：20180726)，共5份，按“2.2”项下方法分别制成样品溶液，进样分析。结果盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯的平均含量和RSD分别为1.88 mg/g(RSD = 0.55%)、71.93 mg/g(RSD = 0.27%)、48.94 mg/g(RSD = 0.25%)，表明本方法的重复性良好。

2.4.6稳定性试验

取按“2.2”项下方法新制备的样品溶液(批号：20180726)，分别在0、1、2、4、8、12、24 h测定3种成分的峰面积，考察稳定性，结果盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯的峰面积RSD分别为3.53%、3.26%、2.88%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.7加样回收率试验

精密称取空白基质1.0 g，共9份，每3份为1组，按低、中、高3个水平分别加入对照品一定量(样品中各成分含量的80%、100%、120%)，按“2.2”项下方法制备，进样分析，结果见表2。盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯的低、中、高浓度的平均回收率均在93%～104%，表明以本法同时测定多效防护霜中3种成分的回收率良好。

表2 加样回收率试验结果

2.4.8耐用性试验

考察4个因素的微小改变对试验结果的影响，包括不同流速(0.9、1.0、1.1 ml/min)，流动相中初始甲醇比例(58%、60%、62%)，柱温(22℃、25℃、28℃)，检测波长(217、218、219 nm)。结果显示，3种成分的峰面积及保留时间的RSD均< 10%，分离度和拖尾因子等系统适用性参数均符合方法学要求，证明方法的耐用性良好。

2.5 样品测定

按“2.2”项下方法制备3个批次的样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，计算样品中盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水杨酸辛酯的含量，结果见表3。

表3 三批样品含量测定结果

3 讨论

3.1 提取方法的优化

本研究根据乳膏剂的特性，选择了提取效率高，操作简便的超声提取法进行样品前处理，对溶剂种类、溶剂体积、提取时间进行考察，最终选择了甲醇50 ml，超声提取20 min的方法。而后采用乙腈对于初提液进行二次提取，可以有效的除去样品中的杂质，让测定的专属性更高。

3.2 色谱条件的选择

对于流动相的选择，本研究先后考察了甲醇-水、乙腈-水-三乙胺、甲醇-磷酸盐缓冲液、甲醇-乙酸铵缓冲液。其中，甲醇-磷酸盐缓冲液条件下，3种成分峰形佳，出峰时间短，但专属性考察，盐酸苯海拉明始终存在无法与杂峰分开的问题，换用甲醇-乙酸铵缓冲液后，通过pH调节，最终获得了较好的分离度，因此选为流动相。对于检测波长的选择，中国药典2015版第二部中盐酸苯海拉明的检测波长为258 nm，通过预实验发现，盐酸苯海拉明在258 nm处紫外吸收较弱，选用该波长对于盐酸苯海拉明含量的测定灵敏度低。而在肩峰218 nm处盐酸苯海拉明有较好的紫外吸收，两种防晒剂甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯也有较好响应，因此选为最佳检测波长(图2)。对于色谱柱的选择，本研究考察了安捷伦、沃特世和资生堂3个品牌的色谱柱，最终选择了安捷伦Extend-C18柱。在pH偏碱性环境下，3个待测成分在该柱上分离度好，峰形佳，所以确定为最佳色谱柱。

图2 紫外波长扫描图 A.盐酸苯海拉明；B.甲氧基肉桂酸辛酯；C.水杨酸辛酯

3.3 含量测定结果分析

3个批次的多效防护霜均为实验室自制，测定结果可以看出，不同批次的样品中盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯的含量有一定波动，这提示我们在进行中试放大生产时，要充分考虑各因素的影响，保证制剂中主要成分的含量稳定，同时对霜剂的长期稳定性也需要进行考察。

本研究建立了HPLC同时测定多效防护霜中盐酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯和水杨酸辛酯的含量的方法。经全面的方法学验证，成功应用于3个批次样品中3种成分的测定，该法简便可靠，可为多效防护霜的质量控制提供依据，也为其质量标准研究奠定了基础。