小麦抗赤霉病鉴定及其抗病基因的检测

徐婷婷，王永军，狄佳春，孙苏阳，蔡士宾，汪巧玲，邹淑琼，朱 银，杨 欣，颜 伟

(1.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业种质资源保护与利用平台/江苏省农业生物学重点实验室，江苏南京 210014；2.江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所，江苏淮安 223001)

小麦赤霉病主要是由禾谷镰孢菌引起的一种小麦真菌病害，广泛发生在世界潮湿和半潮湿地区，严重影响小麦产量和品质，导致严重的经济损失。小麦感染赤霉病后表现病症为小麦根腐、苗枯、茎腐、秆腐和穗腐，除此以外，麦穗和籽粒被病菌侵染后，还会产生真菌毒素，严重危害人畜安全[1-3]。我国小麦赤霉病重发区域主要集中在长江中下游冬麦区和东北东部春麦区。随着气候变化和耕作制度的改变，小麦赤霉病的发病区域已蔓延到黄淮麦区、北方麦区[4]。目前为止，控制赤霉病的主要方式有药剂防治和依赖抗病品种为基础的综合防治技术，在长江中下游麦区取得了一定成效。黄淮麦区长期以来缺少选择压力，生产品种基本不抗赤霉病，随着气候和耕作栽培方式的变化，黄淮麦区已经逐渐成为小麦赤霉病发生的主要区域之一。小麦扬花期的雨水是诱发小麦赤霉病的主要气象因子，抽穗扬花期的降水往往使药物防治丧失最佳的防治时机，而且化学防治还会对土壤和水体环境造成污染。因此，筛选抗性资源，挖掘抗性基因，通过品种改良提高品种抗性是控制黄淮麦区小麦赤霉病危害的最为经济有效的方式。

目前为止，育种家已经挖掘并培育了一些优良抗性小麦品种，比如苏麦3号、望水白、扬麦系列、宁麦系列品种等，主要集中在长江中下游麦区及雨水相对较多的南方地区，其中对苏麦3号、望水白、宁7840等抗性资源，研究应用最为广泛。研究表明，寄主对赤霉病的抗性分为：I型抗性(抗侵染)、II型抗性(抗扩展)、III型抗性(抗DON毒素)和对赤霉病的基础抗性[2,5]。苏麦3号和望水白均具有抗侵染性和抗扩展性，望水白受侵染后DON毒素积累少。但由于抗源品种农艺性状较差，在育种中作为抗性亲本直接利用难度较大[6]。近年来，已有大量的小麦抗赤霉病QTLs被报道，主要是参与II型抗性的位点。位于苏麦3号3BS染色体上的Fhb1，是一个主效QTL，已得到广泛利用[7]，既抗扩展又抗毒素积累[8-10]；Fhb2位于6BS染色体上，是一个抗扩展基因，定位在Xgwm133～Xgwm644区间内[11-12]；Fhb5A是一个抗侵染基因，位于5A 染色体上[13]；Fhb7A位于第7染色体上，是一个抗扩展基因[14-15]，随之又在7DL染色体上检测到一个新的抗赤霉病基因QFhb.cau～7DL[16]；Fhb4与Fhb5是与抗侵染相关的QTL，分别在4BL与5AS的近着丝粒处，分别定位于Xhbg226～ Xgwm149与Xgwm304 ～ Xgwm415区间[17-18]。这些抗性QTLs为小麦抗赤霉病分子育种提供了抗性基因来源。

本研究利用单花滴注对107份小麦资源进行田间赤霉病抗性鉴定，并选取与抗性QTL稳定紧密连锁的分子标记，对供试品种进行抗病基因鉴定，探究其抗性水平与抗性类型，为利用分子标记辅助选择(MAS)方法培育抗赤霉病小麦新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选取黄淮麦区和长江中下游麦区小麦品种共107份(表1)，其中扬麦16与宁麦13作为中抗对照，淮麦20作为中感对照。苏麦3号作为SSR分子标记的对照品种。

1.2 赤霉病抗性田间鉴定与评价

2017-2018年，将供试小麦材料于11月份在江苏省农业科学院六合基地播种，顺序排列，每个品种均种植2行，行长2 m，行距25 cm，每行60株。

赤霉病接种：于小麦扬花期，在穗中部小穗的第1朵小花内，用微量进样器注射10 μL分生孢子悬浮液(1×105个·L-1)接种赤霉病菌，每个株系接种20～30个穗子，然后用透明塑料袋将整个麦穗套住保湿，并挂上纸牌标明接种日期，保湿72 h后去掉塑料袋。

病情记载：单花滴注21 d后，调查接种穗子的病情严重度，计算病情指数。小麦赤霉病严重度分级按《小麦抗赤霉病评价技术规范》(NY/T 1443.4-2007)进行。

1.3 DNA提取

小麦种子在25 ℃恒温培养箱中发芽一周，每个品种随机取10株幼苗，采用CTAB法[19]混合提取植物叶片总DNA，溶解于200 μL TE中，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 SSR标记与PCR扩增

根据前人的研究结果，选取与小麦抗赤霉病QTL(Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5)相关的8个分子标记(Xumn10、XSTS3B～142；Xgwm133、Xgwm644；Xhbg226、Xgwm149；Xgwm304、Xgwm415)。上述引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR反应在Tong96G上进行，总体积为 10 μL，包括2.0 μL DNA模板(10 ng·μL-1)、2 pmol·μL-1引物1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix(0.05 U·μL-1DNA Taq聚合酶，4 mM MgCl2和0.4 mM dNTPs)5 μL和2 μL ddH2O。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35次循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃恒温保存。

1.5 指纹记录

扩增后的PCR产物中加入TE缓冲液至 24 μL。将待检测的进样板置于离心机，1 000 r·min-1离心15 s，然后放入ABI 3130 XL DNA 测序仪中进行毛细管电泳。上机、参数设计、电泳等按仪器操作指南进行。用软件PRO SIZE 2.0 收集原始数据，分析扩增片段峰型，读取片段数据。

2 结果与分析

2.1 供试小麦品种田间对赤霉病的抗性

接种21 d后调查结果显示，小麦品种间具有不同的赤霉病抗性水平(表1)。对照中抗品种宁麦13和扬麦16的赤霉病严重度为0.70和 0.93，病情指数分别为17.39和23.15，对照中感品种淮麦20的赤霉病严重度为1.68，病情指数为41.96。供试品种严重度范围为0.34～ 3.21，病情指数范围为8.62～82.89，呈近正态分布(图1)。病情指数最低为扬富麦101(8.62)，最高为机麦211(82.89)。

根据病情指数对供试小麦品种进行抗赤霉病分级结果(表2)显示，供试品种中病情指数低于17.39(宁麦13的病情指数)，大田表现抗病(R)的品种只有1份，占全部供试小麦的0.93%；病情指数高于17.39且低于32.00的中抗(MR)品种有12份，占全部供试品种的11.21%；中感(MS)品种21份，占全部供试品种的19.63%；大多数为感病品种，占供试品种68.22%。

筛选到的抗赤霉病(R)品种为扬富麦101(扬麦158//镇麦7853/苏肯1号)，可以作为抗性亲本用于赤霉病抗性育种。12个中抗(MR)品种分别为宁麦13、宁麦资119、濮麦1165、扬麦16、宁麦资68、淮阴2016J025、淮阴2016J050、淮阴2016J068、淮阴2016J087、郑品麦25、绿雨918、‘08-65’，表现为赤霉病病程进展缓慢，赤霉病抗性水平较高(图2，A-B)；相比较而言，宁麦13、宁麦资119、扬麦16等来自淮南地区的品种抗性明显优于淮北品种，主要原因可能是长期育种选择和抗病资源应用的结果。从整体上看，中抗以上品种仅占12.15%，中感及感病材料占87.85%，安麦1350、洛麦27、怀川365、机麦211等来自淮北地区的品种病情指数极高，表现出严重的感病性(图2，C-E)。淮阴2016J025、淮阴2016J050、淮阴2016J068等沿淮地区新品系抗性得到一定程度改善。总体上，淮北地区小麦品种赤霉病抗性不强，需要加以改良。

2.2 供试小麦品种的抗赤霉病QTL位点鉴定

为了探究抗赤霉病的QTL位点是否存在于供试小麦品种，利用与赤霉病抗性位点连锁的8个标记，对107份供试品种进行检测，结果如图3A、表3所示。

检测到携带单个或多个赤霉病抗性基因的小麦品种共有52份，其中，携带单个抗性基因Fhb4或Fhb5的小麦品种数目最多，分别为15份和12份，分别占供试品种的14.02%和11.21%，表明这些小麦品种拥有位于4B或5A染色体的抗侵染性主效QTL位点；而携带单个抗扩展基因Fhb1或Fhb2的小麦品种分别有2份和7份；携带2个抗性基因(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5、Fhb2+Fhb4、Fhb2+Fhb5、Fhb4+Fhb5)的小麦品种共有14份，占总供试小麦品种的13.08%；只有2份小麦品种携带3个抗性基因(Fhb2+Fhb4+Fhb5)，为淮阴2016J110、淮阴2016J106。

2.3 分子标记辅助选择小麦抗性品种

为了解与抗性QTL位点紧密连锁的分子标记与小麦赤霉病抗性关系，对携带不同抗性基因及其组合的小麦品种的田间抗病级别进行统计分析，结果如图3B、表3所示。

表1 供试小麦品种(系)及赤霉病抗性鉴定结果

R：抗；MR：中抗；MS：中感；S：感。

R:Resistance; MR:Moderate resistance; MS:Moderate sensibility; S:Susceptibility.

图1 供试小麦品种抗赤霉病病情指数分布

与不携带抗性基因的小麦品种相比，携有单个或多个抗性基因的小麦品种的病情指数大多较低(图3B)，降低的病情指数值范围为0.61～ 24.53。其中携有Fhb1、Fhb2及与Fhb1组合(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5)的小麦品种，其病情指数均降低，降低值分别为 19.79、23.41、15.83、24.53和0.88，抗性基因效应分别为36.08%、42.70%、28.87%、44.73%和1.61%；携有单个抗侵染基因Fhb4的小麦品种病情指数降低了11.33，抗性基因效应为20.66%。表明携有赤霉病抗性基因的品种大多数对赤霉病有抗性。部分含抗性基因的小麦品种的病情指数下降不多，甚至还有所升高，如：Fhb5、Fhb2+Fhb4、Fhb2+Fhb5、Fhb2+Fhb4+Fhb5等组合(表3)。综上所述，携带抗性基因Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5的小麦品种可以作为抗性育种材料。

对抗性品种的抗谱研究发现，赤霉病抗性表现为R、MR和MS级别的品种都或多或少携有抗性位点(表3)。如小麦品种扬富麦101病情指数为8.62，对赤霉病表现为抗病，其携有Fhb1和Fhb4基因；对赤霉病抗性表现为中抗的品种，其严重度范围0.70～1.28，病情指数范围17.39～32.00，且这些中抗小麦品种均携有单个或多个抗性基因，如淮阴2016J087 携有Fhb1基因，宁麦13、宁麦资68携有基因Fhb1+Fhb4等。表明扬富麦101、宁麦13、淮阴2016J087、宁麦资68 等抗性种质可以作为抗性亲本加以利用，并可利用与上述抗性QTL紧密连锁的SSR标记进行分子标记辅助选择。

表2 供试小麦品种的抗赤霉病分类

A：扬麦16；B:扬富麦101；C：淮核13068；D：安麦1350；E：机麦211。

A:Yangmai 16; B:Yangfumai 101; C:Huaihe13068; D:Anmai 1350; E:Jimai 211.

图2 单花滴注接种后21 d穗子

Fig.2 Spikes of wheat on the 21st day after infection

抗性基因效应=(携带抗性基因的品种的病性指数-不含抗性基因品种的病情指数)/不含抗性基因品种的病情指数×100%

Effect of resistance genes=(DI of variety carrying resistance genes-DI of variety without resistance genes)/DI of variety without resistance genes×100%

图3 携带单个或多个赤霉病抗性基因的小麦品种数目(A)和抗性基因效应(B)

Fig.3 Number of wheat germplasm(A)and effect of resistance genes(B)corresponding to resistance genes

表3 小麦资源的赤霉病抗性QTL统计

3 讨 论

随着气候和耕作栽培方式的变化，小麦赤霉病逐渐上升为黄淮麦区的主要病害。黄淮麦区目前育成和推广的品种绝大多数没有达到中抗水平，如在黄淮南片区域进行试验的品种中，中抗品种仅有徐农0029、西农511和保麦6号，其余品种均为中感或高感品种[20-21]。因此在黄淮麦区筛选抗赤霉病资源，强化小麦抗病品种选育具有重要的现实意义。

至今为止，位于3B染色体上Fhb1基因是公认的用于赤霉病改良的优异基因，在小麦抗赤霉病分子标记辅助选择育种中得到了广泛应用[14,22-24]。张 鹏等[25]利用与Fhb1紧密连锁的SSR标记Xgwm493、Xgwm533筛选到含有目标基因的品系。张 旭等[26]利用与抗扩展性、抗侵染性和控制低毒素积累的QTL位点紧密连锁的分子标记，检测到中抗品种宁麦9号拥有抗扩展性主效QTL位点Fhb1和Fhb2。张宏军等[27]利用Fhb1基因的 KASP 标记对携带Fhb1基因的宁麦9号等抗性品种与高感品种周麦16矮败小麦近等基因系构建的回交群体进行基因型分析，发现回交后代中携带Fhb1的家系整体平均病小穗数低，平均病情指数低。本研究中，扬富麦101对赤霉病抗性最强，系谱追溯发现其抗性基因可能来自苏麦3号和扬麦158。苏麦3号高抗赤霉病，以其为抗性亲本虽然创制了一批抗性较好的材料，但是其农艺性状较差，如植株过高、丰产性差，未能得到大面积使用。扬富麦101携带与苏麦3号相同的抗性基因组合Fhb1+Fhb4，却没有苏麦3号综合农艺性状不佳的缺陷，可以作为新的抗性亲本加以利用。

本研究发现，携有Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5、Fhb4+Fhb5抗性基因的小麦品种的病情指数较不携带抗性基因的品种分别降低36.08%、42.07%、20.66%、28.87%、44.73%、1.61%、1.11%，特别是携有Fhb1及与Fhb1组合的小麦品种(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4)的病情指数较低，如抗性品种扬富麦101(Fhb1+Fhb4)和中抗品种宁麦13、宁麦资68、淮阴2016J087均携带Fhb1基因(表3)，表明Fhb1及其抗性基因组合可以有效提高品种抗性，携带该抗性基因的材料可作为抗赤霉病的较好种质。

在抗性育种过程中，分子标记便于筛选、跟踪抗性基因，可以大大提高育种效率。小麦赤霉病抗性是受多基因控制的数量性状[8-18]，在育种中聚合多个抗性基因，可以较快获得携有目标基因的育种材料。本研究也发现，部分分子标记阳性的材料抗性水平并不高(表3)，分析可能有以下几种原因：分子标记与抗性基因之间存在一定的遗传距离，发生了交换，即筛选仅得到的是标记而非基因，可以通过精细定位克隆相关抗性基因，选择与抗性基因共分离的标记提高分子标记的精度；另一方面相关材料遗传背景中可能存在促进病害发生的“感病”基因，基因间的互作，使抗性水平下降。本研究通过单花滴注接种，可以有效提高接种的成功率，但与小麦赤霉病的自然发生存在差异，不能有效区分品种间I型抗性的差异，所以在检测Fhb4、Fhb5基因效应时会存在一定的误差。由于小麦赤霉病抗性是复杂的数量性状，抗性受环境影响非常大，同时生育期、株高等品种特性也会对抗性产生影响，可以通过控制发病条件、增加对照和重复等手段来提高表型鉴定的精度。即使如此，本研究还是利用与抗性QTL紧密连锁的分子标记检测到小麦品种的抗性位点，并鉴定出携有Fhb1和Fhb4基因的小麦抗病品种扬富麦101及携有单个或多个抗性位点中抗级别小麦品种表明分子标记能够快速锁定抗性QTL，通过分子标记辅助选择，可以较快获得携有目标基因的育种材料，大大提高育种效率。