水稻叶片无机磷测定影响因素探究

徐纪明，毛文轩，何秋菊，姜小燕，毛传澡

(浙江大学 生命科学学院，浙江 杭州 310058)

磷是植物生长发育所必需的大量矿质营养元素，由于其在土壤中的含量较低，已成为影响作物产量的重要因素。随着人口数量的增加，粮食的需求也在同步增加。当前作物的高产很大程度上依赖于磷肥等肥料的大量施用。但是，只有大约10%～25%的磷肥能够被当季作物吸收利用，其余的磷肥则被土壤固定或进入水体并导致环境污染[1]。水稻作为我国主要粮食作物之一，其产量的稳定提升是国家粮食安全的重要保障。研究水稻磷吸收利用的分子生理机制，对于提高水稻磷养分吸收利用效率，培育磷高效水稻品种有重要意义[2]。

无机磷含量是分析水稻磷吸收代谢能力的重要指标。无机磷的测定是水稻磷相关研究的必要方法，在突变体筛选、功能基因研究与品种磷效率评价等方面发挥着重要作用，其准确性将直接影响相关的研究结论。目前，水稻中克隆的一系列磷吸收、代谢调控过程中的关键基因，如PHR2、PHF1、SPX家族基因、PHO1、PHO2、PTs等的增强表达或突变体材料中无机磷浓度都发生了相应的变化[3-5]。其中，PHO1、PHO2和PHF1都是通过测定突变体无机磷浓度筛选得到并定位克隆的[5-7]，而其他磷相关基因的功能研究也都离不开无机磷含量的测定[8-10]。

水稻无机磷的测定方法主要有孔雀绿法和钼蓝法[11-13]等，测定方法简单，稳定。但是在实际的无机磷测定过程中，尤其是在取样过程中，会遇到一系列的问题，如不同批次取样时间不同，同批次测定样品数量大、延续时间长、样品存放条件不同，田间取样如何存放，不同取样部位是否对测定结果产生影响等等。阐明无机磷测定过程中的各种条件因子对无机磷浓度测定结果的影响对磷相关研究具有重要的意义。本研究以野生型水稻日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)作为研究对象，研究了取样部位、取样时间、保存条件和保存时间对无机磷测定结果的影响，以期为水稻和植物磷胁迫适应机制的研究和磷高效作物新品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用水稻品种日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻培养

野生型水稻Nipponbare种子用自来水洗净后，用体积分数0.7% HNO3破休眠处理18 h，37 ℃暗处催芽2 d至露白，将露白的种子播于浮在水稻培养液的网纱上。培养液中各成分为：0.091 mmol·L-1KNO3，0.183 mmol·L-1Ca(NO3)2，0.274 mmol·L-1MgSO4，0.183 mmol·L-1(NH4)2SO4，200 mol·L-1KH2PO4，1.0 mol·L-1MnCl2，3 mmol·L-1H3BO3，0.1 mol·L-1(NH4)6Mo7O24，0.4 mol·L-1ZnSO4，0.2 mol·L-1CuSO4，80 mol·L-1NaFe(Ⅲ)-EDTA，2 mmol·L-1MES (pH 5.5)，所有试剂购自国药集团(分析纯)，在水稻生长室中培养7 d后移到50 L水槽中继续培养，3 d更换一次营养液，水稻苗间距为3 cm。水稻培养条件：07:00至19:00温度30 ℃，19:00至07:00温度22 ℃；环境相对湿度(Rh)为80%，光照强度24 000～36 000 lx。

盆栽采用统一规格的塑料桶，将均匀拌好肥料(氮肥用量为纯N 0.2 g·kg-1土，磷肥用量为P2O50.15 g·kg-1土，钾肥用量为K2O 0.15 g·kg-1土)的土壤按10 kg每桶进行分装。然后，将在营养液里生长约2周的野生型水稻移栽至土中，进行淹水栽培，每桶1株，共10桶。分别取抽穗5 d(移栽75 d)和25 d(移栽95 d)的植株旗叶进行无机磷测定。样本统计数为5。

1.2.2 叶片无机磷提取

取水稻叶片并剪碎，放入已称量的2 mL离心管中，并称量，样品与离心管总质量减去离心管质量得到样品质量，样品质量以50～100 mg为宜。离心管中加入氧化锆珠子(直径5 mm)和0.5 mL 5 mol·L-1H2SO4，使用球磨仪破碎匀浆后，转移到15 mL离心管中，并加入5 mL去离子水混匀，使用Whatman定量分析滤纸过滤后进行无机磷浓度测定。

1.2.3 连续流动分析仪测定无机磷浓度

使用连续流动分析仪测定水稻叶片无机磷浓度[14]。连续流动分析仪为荷兰SKALAR分析仪器公司SAN++三通道连续流动分析仪。用含2 000 mg·L-1P的KH2PO4标准磷溶液进行稀释，分别制成1.25、2.50、5.00、10.00、20.00和30.00 mg·L-1P的标准系列溶液。

1.2.4 取样时间

在分析同一天内不同时间对磷浓度的影响时，取样时间设置起始时间为07∶00，每隔3 h取一次样品，共取8次，取倒二叶作为测定对象。其他测定的取样时间为10∶00。

1.2.5 取样部位

野生型水稻长至21 d苗龄时，最新一片完全展开叶为倒一叶。不同叶片无机磷浓度分析时，分别取倒一叶、倒二叶、倒三叶和倒四叶进行无机磷测定；叶片不同部位无机磷浓度分析时，取倒二叶作为测定对象。测定不同苗龄叶片无机磷时，取21、31、41 d苗龄的野生型倒二叶作为测定对象。测定开花前和开花后20 d的旗叶无机磷浓度时，以盆栽种植的野生型水稻旗叶作为测定对象。

1.2.6 鲜样的保存条件和保存时间

在分析保存条件和保存时间对无机磷测定的影响时，将含有水稻叶片的离心管在室温(25 ℃)和低温(4 ℃)条件下放置0、4、8、12、24 h后，进行无机磷测定。

1.2.7 统计分析

采用SPSS18 软件进行单因素方差分析(Duncan)。

2 结果与分析

2.1 取样时间对无机磷含量的影响

数据为3次重复的平均值±标准差。数据以鲜质量计。下同。Results were shown as Data was detected based on fresh weight. The same as below.图1 不同取样时间对无机磷测定的影响Fig.1 Inorganic phosphate concentration of leaves sampled at different times

为确定取样时间对水稻叶片无机磷含量的影响，分析了一天内不同时间点取样样品的无机磷浓度。结果如图1所示，一天内不同时间点的叶片无机磷含量有波动，但是每个时间点之间并没有显著差异。说明一天内不同时间点取样对水稻叶片无机磷含量没有影响。

2.2 不同取样部位对无机磷含量的影响

对营养液培养的21 d苗龄野生型水稻倒一、倒二、倒三和倒四叶的无机磷浓度进行了分析，结果如图2所示。水稻不同部位叶片的无机磷含量差异显著，其中倒一叶无机磷含量最低，为0.69 mg·g-1，倒二叶无机磷含量为1.0 mg·g-1左右，倒三叶无机磷含量为1.16 mg·g-1，显著高于倒二叶(P<0.05)，倒四叶无机磷含量最高，为1.30 mg·g-1。

为分析相同叶片不同部位无机磷含量是否存在差异，将野生型倒二叶分成3段，分别为叶尖、叶中部和叶基部，测定结果发现，叶中部无机磷含量比叶尖浓度稍高，但是没有显著差异(P>0.05)，叶基部无机磷含量最低，比叶中部无机磷含量低19%，且差异显著(P<0.05)。

以上结果说明，不同叶序水稻叶片无机磷含量差异较大，显示为新叶低，老叶高的趋势，而且同一叶片不同部位无机磷含量也有差异，叶基部相对较低。

2.3 不同苗龄对无机磷含量的影响

不同苗龄水稻倒二叶的无机磷含量变化不大，均为1 mg·g-1左右(图4-A)，说明水培条件下不同苗龄水稻叶片无机磷含量保持稳定，不随着叶龄变化而发生波动。开花后水稻籽粒进行灌浆，而灌浆所需的养分大部分来自于旗叶，为确定开花前后旗叶无机磷含量的变化，分别取开花前和开花后旗叶进行无机磷含量测定。结果表明：开花前旗叶无机磷含量为0.47 mg·g-1；开花20 d后，灌浆完成，旗叶无机磷含量下降至0.23 mg·g-1(图4-B)。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.图2 不同取样部位对水稻叶片无机磷含量的影响Fig.2 Inorganic phosphate concentration of different leaves and different tissues in a same leaf

数据为5次重复的平均值 ± 标准差，**表示两样本之间存在极显著差异(P<0.01)。下同。Results were shown as ±s(n=5). ** meant significant difference at the level of P<0.01. The same as below.图3 不同苗龄叶片无机磷含量Fig.3 Inorganic phosphate concentration of leaves at different ages

2.4 取样后保存条件和时间对无机磷含量的影响

无论是室温还是低温条件，经过不同时间放置后，叶片无机磷含量与放置0 h的含量没有显著差异，均为1 mg·g-1左右。说明在取样后24 h之内，不同保存温度下叶片无机磷含量没有显著差异；而且2个不同保存温度下放置不同时间，叶片无机磷含量也没有显著差异，说明相对于低温条件(4 ℃)，室温保存(25 ℃)对水稻叶片无机磷含量没有影响。

图4 保存温度和时间对水稻叶片无机磷含量的影响Fig.4 Effect of preservation temperature and time on inorganic phosphate concentration of leaves

3 讨论

无机磷浓度是研究水稻磷吸收、代谢过程非常重要的指标，反映了水稻对磷的吸收、代谢和转运等能力，在突变体筛选、基因功能研究与遗传育种材料的筛选评价中有重要的指导意义，其测定的准确性直接影响人们对相关材料和相关基因功能的评价结果。本研究详细分析了不同取样时间、取样部位、保存条件和保存时间，以及苗龄对水稻无机磷含量的影响，结果表明，不同取样部位会对无机磷含量产生显著影响，而不同取样时间、取样后在室温或者低温下短期保存(24 h内)均对无机磷含量没有影响；不同苗龄对叶片无机磷含量没有影响，而开花前后旗叶无机磷含量会发生显著变化。

磷是可再利用元素，老叶中的磷可经过叶鞘、节等组织转移到新叶中[15]。磷在转运过程中是以无机磷的形式，通过磷转运蛋白转运，因此，老叶中无机磷浓度高于新叶，而新叶代谢旺盛，大量的磷被代谢利用，合成核酸、磷脂和核蛋白等物质，导致无机磷含量相对较低。对大麦不同叶片无机磷测定结果显示，从新叶到老叶，无机磷含量逐渐升高[16]，本研究结果与此一致，而且本研究中叶片不同部位无机磷含量也不相同，这也可能是因为叶中部和叶尖代谢旺盛，光合作用强烈，因此需要稳定、较高的无机磷浓度的保证，而叶基部细胞结构特化，代谢较弱，要负责无机磷的运进和运出，因此无机磷含量相对较低；另外，老叶中的磷会通过叶基部转运到更新的叶片中利用，这也可能是叶尖磷含量高于叶基部的原因。不同苗龄叶片无机磷测定结果显示，不同苗期叶片无机磷含量变化不大，开花20 d后，叶片无机磷主要转移到种子中，因而开花20 d后旗叶无机磷含量显著降低。根据上述结果，测磷含量时要固定取样部位，可选择倒二叶进行测定[17]，而且取样部位要一致，这样才能进行不同材料或不同处理之间磷含量的比较。

在水稻无机磷测定过程中，有时会遇到测定样品数量很大，或者异地取样，造成样品不能及时测定，一方面会导致取样时间不同，另一方面样品储存时间也不同，储存温度条件也会波动。本研究显示，24 h内不同时间取样对无机磷测定结果没有影响，不同时间点叶片无机磷含量也没有显著差异。取样完毕将样品放到离心管后，室温或者低温条件放置24 h对测定结果不会产生显著影响。首先因为离心管密封性好，放置过程中不会因为水分流失而对质量产生影响，其次可能是因为倒二叶已经发育成熟，叶片细胞内无机磷的消耗和产生达到平衡，取样后24 h内，无机磷浓度不会产生大的变化。具体原因需要进一步研究确定。

本研究分析了取样部位、取样时间、保存条件、保存时间与苗龄等因素对水稻无机磷测定的影响，结果表明，取样部位对无机磷测定结果影响较大，其他因素对结果没有影响。在无机磷测定时需要主要注意取样部位，按照本研究提供的方法，能得到准确、一致的结果。本研究使用的材料为野生型水稻品种日本晴，在使用其他水稻品种或者其他植物，如玉米、小麦、烟草等进行磷代谢相关研究中，也需要注意取样部位不同对无机磷含量测定带来的影响。