灯盏乙素和苷元的理化性质及体内外稳定性研究现状

张培培 李德光 刘红斌 唐当柱

摘要：通过回溯灯盏乙素和苷元的理化性质研究分析对生物利用度的影响及灯盏乙素的人体血浆、体外稳定性条件，认为灯盏乙素溶解性好，但膜通透性差，不利于吸收，而苷元溶解性差，但脂溶性强，膜通透性好，对吸收有利，提示在增加溶解性基础上，以灯盏乙素苷元为对象进行新药开发更有前景。为了提高灯盏乙素和苷元的体内外稳定性，需调pH为2～3，辅加Vc，尽量避免长时间与空气接触。

关键词：灯盏乙素;苷元;理化性质;体内外稳定性

中图分类号：R282.71文献标志码：A文章编号：1007-2349（2019）10-0077-04

灯盏细辛是菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus（Vaniot）Hand.-Mazz.的干燥全草，又名地顶草、灯盏花、地朝阳、双葵花、东菊等。主要产于云南、广西、四川、湖南、贵州及西藏等地，云南的产量占全国资源总量的95%以上。灯盏细辛主要含黄酮类（约47.41%）和咖啡酰类[1-2]。黄酮类主要为灯盏甲素、灯盏乙素（scutellarin，4′，5，6-三羟基黄酮-7-葡糖醛酸苷，又称野黄芩苷）、极少量的灯盏乙素苷元（4′，5，6，7-四羟基黄酮，4′，5，6，7-tetrahydroxy flavone，又称野黄芩素）[3-5]，其中，灯盏乙素含量在灯盏花素中占90%以上，是灯盏花治疗脑血管疾病的主要有效成分[6];灯盏甲素与灯盏乙素的混合物又称灯盏花素;灯盏乙素可在体内酶解、酸解或肠道菌群作用下代谢为灯盏乙素苷元，其生物活性更强[7-8]，口服比灯盏乙素更易吸收，有更好的生物利用度[9]。本文就灯盏乙素及苷元理化性质和体内外稳定性研究进行评述，分析药物理化性质对其生物利用度的影响，就灯盏乙素及苷元的体内外稳定性条件进行总结，为灯盏乙素的药代研究提供参考。

1灯盏乙素及苷元的理化性质

灯盏乙素结构上含有一个羧基和三个酚羟基，显酸性，故在酸性条件下水溶性差，但脂溶性强，油/水分配系数较大。灯盏乙素在酸性介质中溶解度较小，随pH值的升高溶解度急剧增大，稳定性也降低。油/水分配系数研究结果表明[10]，灯盏乙素在pH值较低时，脂溶性较好，油/水分配系数较大;随着pH值升高而减小，在pH=4左右发生突变，油/水分配系数明显降低，然后比较平缓。而灯盏乙素苷元在不同pH值条件下变化不明显，当pH<3时，灯盏乙素苷元的油/水分配系数与灯盏乙素相近;当pH>3时，苷元油/水分配系数不会随pH的变化而改变，脂溶性较好，推测其透膜性要强于灯盏乙素。由于药物口服后，需在胃肠道内溶解才能透过胃肠道黏膜，且灯盏乙素含有葡萄糖醛酸的结构，较大的极性可能会导致膜渗透性低，所以推测口服灯盏乙素后，到达小肠段时溶解性较好，但此时药物主要以离子形式存在，膜透通性较差。

灯盏乙素可被（胃）酸水解为苷元，可被β-葡糖醛酸苷酶（广泛存在于肝肠微粒体中）水解为苷元，可被肠内菌群水解为苷元。灯盏乙素苷元的油/水分配系数明显高于灯盏乙素，表明苷元脂溶性强。灯盏乙素苷元分子量较小，脂溶性较好，易被吸收;口服灯盏乙素后，在吸收进入血液之前胃肠道内灯盏乙素与其苷元并存，而苷元更易于吸收;以总苷元为检测对象的药代动力学试验结果表明，其達峰时间为7h[11]，以灯盏花乙素原型为检测对象，其绝对生物利用度仅为0.4%[12]、2.3%[10]、约5%[13]和0.18%[14]，由此可以推断其主要吸收形式是苷元而不是原型苷。灯盏乙素和灯盏乙素苷元油/水分配系数的差异是体内苷元较灯盏乙素易吸收入血的最好诠释[10]，以灯盏乙素苷元在50%甲醇中的溶解度作为标准，建立灯盏乙素苷元在水中的溶解度曲线，考察灯盏乙素苷元体外溶解性研究发现，当浓度小于102.4μmol·L-1时，灯盏乙素苷元在水中可完全溶解[15]，灯盏乙素苷元具有低溶解性和高渗透性的特点[16]。

灯盏乙素溶解性好，但膜通透性差，不利于吸收，而苷元溶解性差，但脂溶性强，膜通透性好，对吸收有利，提示后期研发中，如以灯盏乙素为研究对象，通过结构改造等方式提高通透性，如以灯盏乙素苷元为对象，可考虑加入助溶剂或将其转化为小分子无机盐增大溶解度，从而提高其利用率。

2灯盏乙素及苷元的稳定性

2.1灯盏乙素及苷元体外稳定性灯盏乙素化学结构含有三个酚羟基，其中两个羟基处于邻位酚羟基，易于氧化，从而导致其稳定性较差。有学者进行不同溶剂中灯盏乙素稳定性考察，结果发现，灯盏乙素在甲醇中相对稳定[10]。灯盏乙素50%甲醇溶液室温放置10h、冷藏3周与0h无显著差异性。提示试验中应选用甲醇为溶剂制备储备液[17]。为了提高灯盏乙素体外稳定性，学者们进行过许多尝试，如通过调节溶剂的pH、加入抗氧剂或者通惰性气体与空气隔离避免氧化。研究结果表明，灯盏乙素在pH1.0-4.0的酸性条件下化学性质稳定，但溶解度降低，药物会析出。pH7.4条件下不稳定，室温放置24h含量降低约一半，随着pH升高灯盏乙素稳定性降低。加入Vc后灯盏乙素溶液中最稳定，可能是由于Vc抗氧化作用和改变药物溶液的pH值。与其它抗氧剂比较，1mg·mL-1 EDTA-2Na的加入使溶液相对稳定[10]。在最不稳定的pH7.4条件下加入稳定性1mg·mL-1 EDTA-2Na，灯盏乙素的稳定性没有得到改善，说明pH对灯盏乙素的影响程度更大。

灯盏乙素苷元的化学结构含有四个酚羟基，其中三个羟基处于邻位酚羟基，更易氧化。结合灯盏乙素的稳定条件，有学者考察灯盏乙素苷元在HBSS溶液中0～25μmol·L-1浓度范围7天内稳定[15]。另有学者考察调pH、加入抗氧剂、螯合剂、惰性气体条件下灯盏乙素苷元的稳定性，研究结果表明，以0.4%Vc（抗坏血酸）作为抗氧保护剂或调节介质pH=5.4加氮气保护可维持灯盏乙素苷元4 h内性质稳定（降解小于4%），单纯的酸性条件并不能维持灯盏乙素苷元的稳定，需加惰性气体或抗氧剂进行双重保护[16]。

2.2灯盏乙素及苷元人体血浆稳定性以灯盏乙素为检测对象，考察了血浆样品在高、中、低三个浓度（320、80、20 ng·mL-1）下的室温放置稳定性（室温放置0 h、12 h），冻融稳定性（反复冻融2次），长期冷冻稳定性（-20℃保存4周），血浆样品处理后流动相复溶稳定性（室温放置10 h），结果表明血浆样品冻融稳定性、长期冷藏稳定性、处理后复溶稳定性良好，样品处理后流动相复溶室温放置10 h内稳定[17]。考察浓度分别为0.02、0.20、2.00 mg·L-1的灯盏乙素未处理含药血浆，室温下放置2h、-30℃冰箱放置30 d、含药血浆处理后室温放置24 h，上述各保存条件下测定的峰面积与0 h偏差均在15%以内，表明上述条件下灯盏乙素稳定[18]。采用高效液相-质谱联用法测定血浆中1mol·L-1盐酸酸水解后灯盏乙素总苷元，对配制好的浓度分别为1.62、0.202、0.0506 mg·L-1的含药血浆分别于室温放置3h、冻融3次、-75℃冰箱中冷冻保存15d进行稳定性考察，结果表明稳定性良好[11]。以灯盏乙素为检测对象，制备浓度分别为0.50、40.00 ng·mL-1的21份人血浆样品，分别于室温放置4h，冻融循环3次，血浆样品处理复溶后室温放置25h，血浆样品提取吹干后冷冻放置25h条件下的稳定性，各保存条件下样品浓度与新鲜制备的样品浓度的RE均<15%，血浆样品稳定[19]。采用固相萃取高效液相色谱法测定人血浆中灯盏乙素，考察0.9133、0.1142、0.0285 μg·mL-1三个浓度的含药血浆样品稳定性，结果表明，灯盏乙素血浆样品在室温下放置4h、冻融3次及冰冻放置30 d条件下均稳定性良好[20]。

有研究表明，如不对血浆样品采取稳定措施，灯盏乙素极不稳定。文献报道[21]灯盏乙素在人血浆中室温放置5min，30%会降解，-20℃放置20天降解50%。浓度分别为50、200、400μg·L-1三个浓度的灯盏乙素含药血浆样品冻融1次后其含量变化不大，冻融2次后含量明显下降，因此进行临床试验时应保证取样后立即测定，未测定的样品置于-40℃冰箱中保存，冷冻1次后测定[22]。

在研究过程中均采取相应措施可避免灯盏乙素的水解、氧化及苷元的氧化反应。取血前在肝素化试管中、样品前处理和标准溶液配制中加入了维生素C，采用β-葡萄糖醛酸苷酶解后，甲醇蛋白沉淀，考察了其反复冻融3次、-20℃放置23d、室温放置4h，处理后的进样溶液放置24h的稳定性，经实测浓度与加入浓度进行比较，灯盏乙素苷元浓度变化在-14.18%～1.09%，灯盏乙素浓度变化-14.09%～2.62%，实验表明加入维生素C可增加灯盏乙素及苷元的稳定性[23]。通过加入磷酸或甲酸调pH2～3，提高灯盏乙素稳定性，并且降低pH有助于提高提取率。血浆中异灯盏乙素通过加入AlCl3室温放置1h相对稳定[21]。发现0.002和0.005 mol·L-1的EDTA溶液对提高灯盏乙素稳定性的效果极佳，EDTA增加灯盏乙素稳定性可能是EDTA络和酶中金属离子导致酶失活的结果。然而，EDTA二钠盐是强碱弱酸盐，过量EDTA能使血浆碱化，黄酮化合物分子中有邻二酚羟基取代时，在碱性溶液中不稳定，易被氧化[24]。

灯盏乙素是含多个酚羟基的黃酮苷，在室温下不稳定，容易分解或被氧化。因此，在试验中尽量避免样品在室温下久置，配好的样品立即密封冰箱中保存，并尽快进行测定，或在测定过程中采取调节pH或加入抗氧化剂的方法提高灯盏乙素及苷元的稳定性。

以上文献均以灯盏乙素为检测对象，血浆中未加入稳定剂但灯盏乙素仍稳定的原因，推测可能是血浆样品在保存及处理过程中密闭较好，较少接触空气。或活浆中原有酶活性较低，因新鲜血浆酶活性高，易引起灯盏乙素降解，而经过反复冻融或保存较久的血浆，酶活力降低，因而稳定性较好。

3小结

3.1口服药物只有先充分溶解才有可能被胃肠吸收，仅从溶解角度分析灯盏乙素给药，苷极性大，溶解性相对较好，但其膜通透性差，且苷键断裂后与内源性葡萄糖或其它物质结合生成药效物质的过程，而苷元膜通透性较好，吸收较好较快，且没有苷键断裂这个过程，与灯盏乙素相比，以苷元为主体进行药物开发，促进吸收，减小个体差异，溶解度小的问题可通过合成灯盏乙素苷元的小分子无机盐或进行结构修饰改造，增加溶解度的同时不影响吸收。

3.2灯盏乙素容易被血浆中的内源酶酶解或被空气氧化降解，灯盏乙素及苷元在酸性条件下稳定性较好（pH<5），碱性条件下不稳定，如果需长期保持稳定性，单纯的酸性条件无法满足要求，需辅以惰性气体或抗氧剂（抗坏血酸），综上所述及笔者前期实验结果，抗坏血酸（Vc）对于保持灯盏乙素及苷元的体内外稳定性非常有利。在全血、血浆或样品处理及进样过程中加入酸调pH至2～3，或通过加入Vc、EDTA-2Na等稳定剂，且在整个过程中注意减少与空气接触，提高灯盏乙素及苷元在生物样品中的稳定性。

3.3以灯盏乙素为对象进行开发研究应解决其通透性差的难题，开发灯盏乙素苷元，应提高其溶解性;由于其基本母核具有不稳定的通性，因此在研究过程中均需采取调pH，且辅加Vc、避免长时间暴露在空气中，提高灯盏乙素及苷元稳定性，保证研究数据的准确、可靠。

由于灯盏乙素进入体内后酶解、酸解或肠道菌群水解以苷元[25-26]的形式吸收入血，后又被转化生成灯盏乙素、异灯盏乙素[27]等系列物质，灯盏乙素体内过程复杂，代谢物众多，其真正的有效物质基础仍需进一步研究;国内外对灯盏乙素苷元[28-35]动物体内的吸收和代谢已有研究，但其血浆蛋白结合率、体内分布、排泄情况等研究仍鲜见报道。关于异灯盏乙素的具体种类、理化性质、体内外稳定性和药理活性等方面，均有待进一步研究。

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