人舌鳞癌耐顺铂细胞株的建立及鉴定

杨晓红 胡小华(通信作者) 钟雯怡 杨琨 易杰 姚礼 张立刚

563000遵义医科大学附属口腔医院修复科，贵州 遵义

舌癌(tongue carcinoma)是口腔癌中最常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高、生长快、浸润性强、易早期发生淋巴结转移、单纯手术后易复发等特点。化学药物治疗是目前乃至将来相当长时间内舌癌的主要临床治疗手段之一，其中以顺铂为基础的化疗是临床最常用的化疗方案。然而，迄今恶性肿瘤的化疗效果仍极为有限，其原因主要是绝大部分肿瘤细胞具备或产生了对化疗药物的耐受性，从而使化疗药物起不到其应有的作用[1-2]。因此，如何解决耐药问题是抗肿瘤研究的当务之急。目前，国内口腔癌研究领域舌鳞癌的多药耐药细胞株较为稀有，严重制约及影响了口腔癌多药耐药机制研究。而本研究通过体外顺铂逐步增量诱导的方式，建立OSC-19的耐药细胞株，并进行多药耐药性检测及鉴定，为解决口腔癌多药耐药机制研究问题提供了稳定的细胞模型。

资料与方法

材料：OSC-19细胞株：购买于中科院上海细胞库，来源于61 岁男性亚洲人舌鳞癌组织，呈上皮样贴壁生长。试剂：DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素链霉素、CCK-8 试剂盒。药品：顺铂。仪器：CO2细胞培养箱、倒置相差显微镜。

人舌鳞癌细胞OSC-19耐顺铂细胞株的建立：复苏OSC-19 细胞培养于含有10%胎牛血清的DEME 高糖培养基中，置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养；采用浓度逐步递增顺铂(CDDP)不间断作用方法诱导细胞多药耐药，CDDP 从0.1 μg/mL 开始诱导，每个浓度点稳定生长后再增加0.1 μg/mL 浓度，最后到1.5 μg/mL CDDP 浓度后，细胞稳定生长，多药耐药细胞株建立后进行相关检测。

图1 亲代OSC-19细胞及耐顺铂浓度逐步增加时的细胞形态学变化(标尺=100μm)

CCK-8 法检测OSC-19/CDDP 细胞耐药性：将处于对数生长期的OSC-19 和OSC-19/CDDP 细胞以6×103cells/孔的密度接种到96 孔板中，每孔含100 μL DMEM，混合均匀后，常规条件下培养24 h，使细胞贴壁。弃去每孔上清液，设置空白对照组：不加细胞仅含培养液的空白对照；阴性对照组：不加药物仅加细胞的阴性对照；试验组：不同浓度的顺铂(CDDP)。按照浓度梯度给予含药物培养液100 μL，每一浓度平行5 个复孔作为试验组。另设置5 孔只加入细胞和培养液的阴性对照组及5孔没有加入细胞的空白对照组。培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8及90 μL 不含胎牛血清的培养液。37℃孵育1 h。酶标仪测450 nm处的吸光度值A。按公式1计算细胞存活率。并用GraphPad Prism 5 软件拟合量效关系，求半数抑制浓度IC50值后按公式2计算耐药指数(resistance index，RI)。

公式1：细胞生存率(%)=(试验组平均A 值-空白对照组平均A 值)/(阴性对照组平均A 值-空白对照组平均A 值)×100%。公式2：RI=(OSC-19/CDDP 细胞的IC50)/(OSC-19细胞的IC50)。

统计学方法：采用SPSS 17.0 统计学软件分析数据。计量资料用(±s)表示，采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

人舌鳞癌细胞株OSC-19与诱导耐药过程的形态学变化：倒置显微镜下观察：OSC-19细胞体积及胞核均较小，胞浆较丰富，呈均匀铺路石状生长(图1A)；随着耐顺铂浓度的增加，细胞体积及胞核均变大，胞浆中细胞颗粒增多，细胞边缘伸出树突状凸起，并以此与邻近细胞连接(图1B～D)。

OSC-19/CDDP 细胞耐药性检测：经CCK-8法检测及GraphPad Prism 5软件拟合量效关系，得出OSC-19 及OSC-19/CDDP细胞对CDDP的半数抑制浓度(IC50)分别为4.55 μg/mL及79.06 μg/mL，耐药指数(RI)为16.70。

讨 论

肿瘤细胞对化疗药物的耐药性已成为肿瘤化疗的主要障碍，探索耐药性的产生机制，逆转肿瘤细胞的耐药性，是提高肿瘤化疗效果的关键。而在体外建立稳定的耐药细胞株模型，是细胞耐药的实验研究中探讨耐药分子机制的基础。国内学者一直在努力建立稳定的口腔癌耐药细胞系，例如利用顺铂成功诱导了口腔腺癌ACCM 的耐药性形成和利用阿霉素持续增量诱导建立了TCA-8113舌癌耐药株细胞[3-4]，但前者研究的是腺癌，而不是临床常见的鳞癌；后者虽然成功形成了舌癌耐药细胞株，但是其癌干细胞特征不明显，而有研究表明癌干细胞可能为临床化疗耐药的重要机制[5]，而且单一的耐药株并不利于耐药机制的研究，因此，我们选用来源于61 岁男性亚洲人舌鳞癌组织OSC-19细胞株作为细胞来源，以期建立另一株符合临床实际的耐药细胞株。

CDDP是一种细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药物，DNA 是其主要靶点，与DNA结合会导致DNA损伤并诱发细胞凋亡；被广泛用于多种肿瘤的治疗，在头颈部恶性肿瘤中单药有效率可达25%～41%，联合化疗有效率达67%[6]；自1978年被美国食品和药物管理局(FDA)批准使用以来，以CDDP 为主的化疗方案就成为头颈部鳞癌的一线治疗方案。本研究中通过CDDP 从低浓度递增的持续诱导方法，成功建立了生长稳定的耐药舌鳞癌细胞株OSC-19/CDDP，通过IC50 数值的耐药倍数比较其耐药指数高达16.7；说明体外CDDP 浓度递增法长时处理能够成功诱导并建立舌鳞癌细胞株。研究中发现，随着CDDP 浓度的增加，多药耐药株的形态也从亲代细胞体积较小，胞核较小，胞浆较丰富，转变为细胞体积大，胞核变大，胞浆中出现细胞颗粒增多的情况，可能是存在化疗药物经细胞排除增多，形成耐药性的一种表现；并且细胞死亡的情况增加，细胞从鹅卵石形态变为不规则的多边形，异质性较多，“空泡样”细胞的形态增多。在研究中还发现，OSC-19 细胞在CDDP 从0.1 μg/mL 到1 μg/mL 的浓度递增过程中，细胞生长稳定后增加0.1 μg/mL的药物浓度，细胞很快能达到生长稳定状态。但在1 ～1.5 μg/mL 浓度递增过程中，细胞较不易达到理想生长状态，其间存在1.2 μg/mLCDDP 浓度处理后细胞大量死亡而回调至1 μg/mL待细胞完全生长稳定后减少增加浓度至0.05 μg/mL，通过反复回调使细胞耐药浓度稳定达到1.5 μg/mL，其原因有待进一步研究。

OSC-19/CDDP 细胞对CDDP 耐药特性已经在体外得到了初步证实，还需在体内进一步证实其耐药性及耐药指数等，是否具有多药耐药性等亦尚需进一步实验证实。