亚甲酰胺异羟肟酸联合索拉非尼对肝癌细胞迁移与侵袭的影响

郝大林 孙成学 肖福斌 邓放

(北华大学附属医院 1感染肝病科，吉林 吉林 132011； 2肝胆胰外科)

手术治疗是首选的肝癌治疗方案，但由于肝癌的早期病变恶性程度高、发病隐匿、诊断率低，使得很多患者丧失了手术治疗的机会〔1〕。因此，研究肝癌的其他有效治疗手段是当务之急。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(HDACI)亚甲酰胺异羟肟酸(SAHA)和索拉非尼(SRFN)是临床上常用的治疗肝癌的药物，主要用于一些无法通过手术治疗的肝癌患者〔2〕。联合应用SAHA和SRFN可以提高疗效，减少毒副作用，达到综合治疗肝细胞癌(HCC)的效果〔3〕。本实验拟探讨SAHA与SRFN协同作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养与分组 HepG2 细胞株(购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库)放置于 37℃、二氧化碳浓度为5%的孵育箱中进行培养。培养基的组成成分为含 10%灭活小牛血清的 RPMI1640 及含 1%的青霉素与链霉素双抗。细胞为上皮样细胞，传代频率为2～3 d/次，取对数生长期的细胞为研究样本。分为对照组(未处理)、SAHA(1.5 μmol/L SAHA处理)、SRFN(1.5 μmol/L SRFN处理)和SAHA联合SRFN组(1.5 μmol/L SAHA和1.5 μmol/L SAHA处理)。

1.2划痕法检测细胞侵袭 将5×105个细胞悬液均匀接种于6孔细胞培养板，用上述药物处理24 h后，垂直使用10 μl的吸管尖端，产生细胞单层的划痕。弃去旧培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，去除划痕细胞，加入新的培养液。倒置显微镜下观察划痕宽度及细胞密度比较一致的部分做标记，分别在不同时间点拍照测量划痕宽度并观察划痕的愈合速度。

1.3Transwell法检测细胞迁移 将无胎牛血清(FBS)的DMEM(1∶3)以60 μl/室加入Transwells顶腔，常温放置2 h，在无血清DMEM中培养对数生长期细胞24 h，制成密度为1×105细胞/ml的细胞悬液。将200 μl的细胞悬浮液加入Matlab涂覆的顶层室中。将插入物放入含有500 μl DMEM、10%FBS的24孔板的底部室孔中培养24 h。将细胞固定在4%甲醛中15 min，然后用0.25%的结晶紫染色25 min，在空气干燥前用无菌水冲洗插入物。无菌工作台空气干燥后，拍摄细胞膜，测定细胞计数。

1.4Western印迹检测不同处理组细胞中蛋白水平 用SAHA、SRFN或SAHA联合SRFN处理后，以细胞总蛋白提取试剂盒提取HepG2细胞的总蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋白(100 μg)转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。硝酸纤维素膜依次经过封闭、一抗孵育、洗膜、辣根过氧化物酶耦联的二抗孵育、洗膜，最后采用化学发光显色试剂显影并摄像。

1.5统计分析 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1SAHA、SRFN或SAHA联合SRFN对HepG2细胞侵袭的影响 与对照组(100.0%)相比，SAHA、SRFN、SAHA联合SRFN组侵袭能力分别为69.0%、47.8%和15.0%，见图1。

图1 各组HepG2细胞侵袭(×10)

2.2SAHA、SRFN或SAHA联合SRFN对HepG2细胞迁移的影响 与对照组(100.0%)相比，SAHA、SRFN、SAHA联合SRFN组迁移能力分别为56.0%、47.0%和3.5%，处理不同时间的划痕试验结果见图2。

图2 各组不同处理时间HepG2细胞迁移(×10)

2.3SAHA、SRFN或SAHA联合SRFN对HepG2细胞相关蛋白表达的影响 与对照组相比，SAHA或SRFN显著上调E-cadherin蛋白的表达(P<0.05)。SAHA联合SRFN组E-cadherin蛋白表达显著高于SAHA或SRFN组(P<0.05)。SAHA或SRFN显著下调MMP-2、Vimentin的表达(P<0.05)，而对MMP-9蛋白表达无明显影响。SAHA联合SRFN组MMP-2和Vimentin的表达显著低于SAHA或SRFN组(P<0.05)。见图3。

图3 各组HepG2细胞相关蛋白表达

3 讨 论

HDACI通过抑制HDAC活性、调节组蛋白乙酰化状态、促进抗肿瘤转录因子的转录和表达、调节相关信号通路发挥抗肿瘤生物学效应〔4〕。SAHA是最具代表性的HDACI之一，它通过抑制肿瘤细胞核酸、染色质的组蛋白乙酰化状态，进而抑制其增殖、分化功能发挥作用。研究显示，SAHA通过调节基因，提高肿瘤细胞对其他化疗的敏感性，达到治疗癌症的目的〔3〕。尽管SAHA和SRFN的作用靶点不同，但肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和迁移受DNA调控，说明两者联合可能具有协同抗肿瘤作用。SAHA联合SRFN对HepG2迁移和侵袭的抑制作用明显强于SAHA和SRFN。Cha等〔5〕研究不同抗肿瘤药物作用靶点不同，但均通过诱导肿瘤细胞凋亡和改变肿瘤组织内环境而显示出抗肿瘤活性。细胞周期阻滞与细胞凋亡间有重要联系。

本研究还发现SAHA联合SRFN对HepG2细胞的侵袭和迁移的抑制作用比SAHA和SRFN单独作用要强。肿瘤细胞的侵袭和迁移能力在促进原发肿瘤疾病进展中起着重要作用，而降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是抗肿瘤药物抑制肿瘤疾病进展的重要方面。肿瘤细胞的上皮-间充质转化(EMT)可增强其侵袭和迁移能力，可导致肿瘤进一步恶化〔6〕。MMP-2、MMP-9、vimentin和E-cadherin是EMT的重要标志蛋白〔7〕。MMP-2和MMP-9蛋白是MMP家族的两个重要成员，另有研究表明MMP是EMT过程中最重要的蛋白水解酶。MMP-2和MMP-9在肺癌细胞的EMT过程中表达显著上调，与肺癌细胞的侵袭和迁移能力有关〔8〕，Yang等〔9〕还发现MMP-2的表达与肝癌细胞迁移能力呈正相关。然而，vimentin蛋白被认为是EMT过程中发挥作用的一个重要蛋白。Ulirsch等〔10〕发现vimentin蛋白能促进乳腺癌细胞的迁移和转移。E-cadherin在肿瘤细胞的EMT过程中与MMPs和波形蛋白有相反的作用。E-cadherin是EMT过程中的一种上皮性标志物，可抑制肿瘤细胞的迁移，E-cadherin蛋白表达上调表明肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强。本研究发现相对于SAHA和SRFN的表达，SAHA联合SRFN显著下调MMP-2和vimentin蛋白的表达，上调E-cadherin蛋白，表明这是SAHA和SRFN联合用药抗侵袭和迁移的分子机制。同时，SAHA和SRFN之间存在协同和叠加效应。