微量MIC法和罗氏比例法对结核分枝杆菌药敏检测比对及一致性观察分析

王 慧，齐 鹏，刘 昕，马莹聪，朱琳莹

(吉林省疾病预防控制中心，吉林 长春130000)

结核病是由于感染结合分枝杆菌而引发的慢性传染病，治疗方法为都药物联合短程化疗，近年来，抗结核药物耐药性结核分支杆菌出现，且钢钒传播，使得控制结核病存在一定难度。当前，全球结核疫情控制的一个最大障碍为结耐药结核病。有关研究数据表明[1]，广泛耐药结核病具有传染期常、痰菌转阴慢等特点，其诊断与治疗过程较为复杂，所需治疗费用较高，且具有较多不良反应[2]。本文将以200株结核分枝杆菌菌株为对象，探究微量液体培养基最低抑菌浓度(微量MIC法)和罗氏比例法对结核分枝杆菌药敏检测情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究涉及对象为结核分枝杆菌菌株200株，研究时间为2018年1月-2018年12月，所有菌株均经结核药物抗敏性熟练度测试，由国家结核病实验室提供。

1.2 方法

1.2.1设备：固体培养基，微量MIC商品化微孔板。

1.2.2药敏试验方法：(1)微量MIC法:使用罗氏培养结核分枝杆菌菌株2-3周，应用无菌生理盐水(浓度为0.5%)进行溶解与稀释，取标准麦氏比浊管进行比浊，制作为1 mg/ml菌悬液，并吸取0.2 ml菌悬液，添加至培养液内，在充分混合以后，作为工作菌液。使用无菌吸管将工作菌液吸出0.5 ml，并在各个孔板中滴入，盖上盖子，将药敏板在自封袋中放入，调整温度为37℃进行孵育，在6天以后对质控孔进行观察，若质控孔有白色颗粒沉淀出现，添加显色剂A与显色剂B ，分别12 μl与25μl，调整温度为37℃进行孵育1-2天。药敏板中药物终浓度如表1所示。(2)罗氏比例法：使用接种环取新鲜菌落(1-2周)，放入磨菌瓶中，添加生理盐水，经过震荡与静置以后，取上部菌液，并和麦氏比浊管进行比浊，制作为1 mg/ml的菌悬液，经过100倍稀释，直至10-2mg/ml，随后再稀释，直至10-4mg/ml，获得两种浓度工作菌液，使用22SWG标准接种环选取不同浓度工作菌液接种，直至含药培养基的斜面。药敏板中药物终浓度如表1所示。

表1 药物终浓度(μg/ml)

1.2.3结果判定：(1)微量MIC法：调整温度为36℃进行孵育，添加显色剂A与显色剂B，在培养1-2天以后，质控孔为红色，与其他药敏孔相比，蓝色则为敏感，红色则为耐药。若H孔为红色，L孔为蓝色，则需要重复试验。(2)罗氏比例法：调整温度为36℃时，在4周以后，计算耐药的百分比，若为1%以上即为耐药，高度稀释度的空白对照培养基的菌落低于20个，需要重复试验。

1.3 统计学方法

本研究应用SAS统计学软件，以罗氏比例法作为金标准，检测结果一致性使用Kappa检验方法，若Kappa值超过0.75，表示两种方法一致性良好；若Kappa在0.4-0.75之间，表示两种方法存在一般的一致性；若Kappa值低于0.4，表示具有不佳的一致性。

2 结果

2.1 两种方法耐药性分析

微量MIC法的异烟肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素药物耐药性检出率与罗氏比例法相比，组间差异呈P>0.05，具有可比性。如表2。

表2 两种方法耐药性分析(n/n%)

2.2 两组检验方法相比结果分析

以罗氏比例法作为金标准，在异烟肼、利福平、二卡那霉素耐药性检出具有较高的特异度与灵敏度，且两种检验方法一致性良好；卷曲霉素的灵敏度较低，且两种检验方法一致性不佳。如表3。

表3 两组检验方法相比结果分析

3 讨论

耐药结核病发生与流程成为防治结核病工作领域关注焦点与难点。当前，全球结核病发病率逐渐增高，且抗结核药物大量使用[3]，这就使得耐多药菌株不但扩散，被视为结核病控制的重大问题，特别是亚洲发展中国家。因此，快速、准确的抗结核药物药敏试验可有效筛查出广泛耐药结核病，并确定广泛耐药结核病，有助于预防进一步加重耐药性，为疾病的治疗提供参考依据[4]。

本次研究中，运用微量MIC法对结核菌株异烟肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素等药物敏感性进行试验，结果可见，以罗氏比例法作为金标准，在异烟肼、利福平、二卡那霉素耐药性检出具有较高的特异度与灵敏度，且两种检验方法一致性良好；卷曲霉素的灵敏度较低，且两种检验方法一致性不佳。其中特异度多为85%以上，灵敏度部分也高达90%。其中CMP一致性较差的原因可能为商品化微孔板中药物浓度值较低[5]。本次研究结果显示，微量MIC法的异烟肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星、卷曲霉素药物耐药性检出率与罗氏比例法相比，组间差异呈P>0.05，具有可比性。与吴昌琴学者研究结果保持一致，均证实了微量MIC法应用于结核分歧杆菌的药敏检测中具有重要意义。由此可见，微量MIC法、比例法在结核分枝杆菌的药敏检测中，除了CPM以外，均具有良好一致性，对结合患者的药敏试验提供廉价、快速有效的方法。

综上所述，微量MIC法与罗氏比例法均可用于结核分枝杆菌的药敏检验中，在异烟肼、利福平、乙胺丁醇、二卡那霉素、氧氟沙星的药敏检验具有较高的一致性，而卷曲霉素一致性不佳。