超声波-乙醇法提取甜茶总黄酮工艺优化

钟翠娟 王小明 张鹏 蒋敏

摘要 采用超声波-乙醇提取法从甜茶中提取总黄酮，考察乙醇浓度、料液比、超声波功率、提取温度、提取时间对甜茶中总黄酮提取得率的影响，通过单因素试验和正交试验得出甜茶中总黄酮超声波-乙醇提取法的最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶35（g∶mL）、超声波功率80 W、提取温度60℃、提取时间65min，此条件下，甜茶中总黄酮提取得率为7.41%。

关键词 甜茶;总黄酮;超声波;提取得率

中图分类号 TQ461文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）20-0172-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.046

開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Extraction of Total Flavonoids from Sweet Tea by Ultrasonic Ethanol Method

ZHONG Cui juan WANG Xiao ming ZHANG Peng1，2 et al （1.College of Food & Biochemical Engineering，Guangxi Science & Technology Normal University，Laibin，Guangxi 546199;2.Key Laboratory for Research and Development of Characteristic Yao Medicine Resources，Guangxi Science & Technology Normal University，Laibin，Guangxi 546119）

Abstract The effects of ethanol concentration， ratio of material to liquid， ultrasonic power， extraction temperature and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from sweet tea were investigated by ultrasonic ethanol extraction method. The optimum extraction conditions of total flavonoids from sweet tea obtained by single factor experiment and orthogonal test were as follows： ethanol concentration 60%， ratio of material to liquid 1∶35 （g∶mL）， ultrasonic power 80 W. When the extraction temperature was 60 ℃ and the extraction time was 65 min， the extraction rate of total flavonoids in sweet tea was 7.41 %.

Key words Sweet tea;Total flavonoids;Ultrasonic;Extraction yield

蔷薇科甜茶，又名甜叶悬钩子，在广西被称为“神茶”，是我国广西唯一一种既能作处方药又能作茶饮的天然“药食同源”茶[1]。广西甜茶集中分布在广西中南部，尤以金秀大瑶山甜茶为代表。甜茶含有甜茶素、甜茶多酚和黄酮类化合物等成分[2]。饮用甜茶有润肺、清热、醒酒、降脂、降压、降胆固醇、抑制和延缓血管硬化、防治冠心病及关节炎等效果;还能防治热咳、口腔炎、咽喉炎、声音嘶哑等症状[3];同时还具有提高人体免疫力的保健功能。研究证明，甜茶所含的黄酮类化合物具有重要利用价值，得到国内外食品及医药界广泛重视。提取甜茶总黄酮方法有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、β-环糊精提取法、酶辅助提取法、超微粉碎法、机械化学辅助提取法等[4]。而超声波辅助提取法具有提取时间短、提取温度低、提取得率高等特点[5]。

该试验采用超声波-乙醇法从甜茶中提取总黄酮，通过单因素和正交试验得出超声波-乙醇法提取甜茶中总黄酮的最佳工艺条件，为甜茶叶总黄酮进一步开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法。

1.1 材料与试剂

干甜茶，产自广西来宾市金秀县（甜茶叶的嫩叶与老叶比约为1∶ 按绿茶加工工艺生产，水分含量49.3 g/kg，粉碎后过80目筛备用）;芦丁标准品（95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）;电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）;FW177中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;BILON-2000CT多用途恒温超声波提取机（上海比朗仪器制造有限公司）;UV-2600紫外可见分光光度计（岛津企业管理有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮浓度测定方法。

1.3.1.1 标准曲线的测定[ 6-9]。准确称量芦丁标准品25.0 mg于烧杯中，以60%乙醇溶液溶解并定容到250 mL容量瓶中，配制得0.1 mg/mL芦丁标准对照液。准确移取芦丁标准对照液0.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于10 mL试管中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇晃混合均匀，静置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇晃混合均匀，静置6 min，再加4%氢氧化钠溶液5 mL，以60%乙醇溶液定容至10 mL刻度，摇晃混合均匀，静置20 min，得到的芦丁标准液浓度分别是0.000、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050 mg/mL，以浓度为0.000 mg/mL的标液为空白对照，在400～700 nm下进行全波长扫描，均测出在510 nm处有最大吸光度，因此以510 nm波长为芦丁标准液的测定波长。以芦丁标准液浓度为纵坐标（y）和吸光度为横坐标（x）进行线性回归，由图1可知，所得线性回归方程为y=0.088 2x+0.000 002，R2=0.999 8>0.99，表明该标准曲线具有良好线性关系，可作为标准参考曲线。

1.3.1.2 显色溶液的制备。准确移取待测样品溶液2 mL置于10 mL试管中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇晃混合均匀，静置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇晃混合均匀，静置6 min，再加4%氢氧化钠溶液5 mL，以水定容至10 mL刻度，摇晃混合均匀，静置20 min，即得到显色溶液。

1.3.1.3 总黄酮浓度和提取率测定。按“1.3.1.2”方法制备得到显色溶液，以510 nm为样品溶液测定波长，在该波长下测定显色溶液的吸光度x 代入“1.3.1.1”線性回归方程算出显色溶液的总黄酮浓度y1。按公式（1）计算显色溶液的总黄酮浓度y1;按公式（2）计算样液溶液的总黄酮浓度y2，按公式（3）计算总黄酮提取得率。

y1（mg/mL）=0.088 2x1+0.000 002（1）

y2（mg/mL）=y12×10（2）

总黄酮的提取得率=y2×v1 000×m×100% （3）

式中，y1为显色溶液的总黄酮浓度（mg/mL）;y2为样品溶液的总黄酮浓度（mg/mL）;v为提取液定容体积（mL）;m为甜茶干粉质量（g）。

1.3.2 超声波-乙醇提取总黄酮单因素试验方法。

1.3.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取得率的影响。取甜茶于105 ℃鼓风干燥箱中烘干2 h，经粉碎机粉碎，过80目筛备用。准确称取甜茶干粉末各2 g置于250 mL烧杯中，以甜茶总黄酮提取得率为评价指标进行单因素试验，分别研究不同体积分数乙醇对超声波-乙醇提取甜茶总黄酮的影响。按甜茶粉末质量与乙醇体积比1∶30（g∶mL）、超声波功率80 W、提取温度50 ℃、提取时间45 min，开展不同乙醇浓度（50%、55%、60%、65%、70%）提取甜茶叶总黄酮得率的单因素试验。提取液于4 500 r/min离心分离6 min，收集上清液，用蒸馏水清洗沉淀，离心分离2次收集上清液，将上清液定容于1 000 mL容量瓶中，测定甜茶总黄酮提取得率，找出最佳乙醇浓度[9-12]。

1.3.2.2 料液比对总黄酮提取得率的影响。准确称取甜茶干粉各2 g置于250 mL烧杯中，以甜茶总黄酮提取得率为评价指标进行单因素试验，分别研究不同甜茶粉质量与乙醇体积比对超声波-乙醇提取甜茶总黄酮的影响。按单因素试验所得的最佳乙醇浓度、超声波功率80 W、提取温度50 ℃、提取时间45 min，开展不同料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶mL））对提取甜茶总黄酮得率的单因素试验。提取液于4 500 r/min离心分离6 min，收集上清液，用蒸馏水清洗沉淀，离心分离2次收集上清液，将上清液定容于1 000 mL容量瓶中，测定甜茶总黄酮提取得率，找出最佳甜茶粉质量与乙醇体积比（料液比）。

1.3.2.3 超声波功率对总黄酮提取得率的影响。准确称取甜茶干粉各2 g置于250 mL烧杯中，以甜茶总黄酮提取得率为评价指标进行单因素试验，分别研究不同超声波功率对超声波-乙醇提取甜茶总黄酮的影响。按单因素试验所得的最佳乙醇浓度、最佳料液比、提取温度50 ℃、提取时间45 min，开展不同超声波功率（40、60、80、100、120 W）对提取甜茶总黄酮得率的单因素试验。提取液于4 500 r/min离心分离6 min，收集上清液，用蒸馏水清洗沉淀，离心分离2次收集上清液，将上清液定容于1 000 mL容量瓶中，测定甜茶总黄酮提取得率，找出最佳超声波功率。

1.3.2.4 提取温度对总黄酮提取得率的影响。准确称取甜茶干粉各2 g置于250 mL烧杯中，以甜茶总黄酮提取得率为评价指标进行单因素试验，分别研究不同提取温度对超声波-乙醇提取甜茶总黄酮的影响。按单因素试验所得的最佳乙醇浓度、最佳料液比、最佳超声波功率、提取时间45 min，开展不同提取温度（30、40、50、60、70 ℃）对提取甜茶总黄酮得率的单因素试验。提取液于4 500 r/min离心分离6 min，收集上清液，用蒸馏水清洗沉淀，离心分离2次收集上清液，将上清液定容于1 000 mL容量瓶中，测定甜茶总黄酮提取得率，找出最佳提取温度。

1.3.2.5 提取时间对总黄酮提取得率的影响。准确称取甜茶干粉各2 g置于250 mL烧杯中，以甜茶总黄酮提取得率为评价指标进行单因素试验，分别研究不同提取时间对超声波-乙醇提取甜茶总黄酮的影响。按单因素试验所得的最佳乙醇浓度、最佳料液比、最佳超声波功率、最佳提取温度，开展不同提取时间（25、35、45、55、65 min）对提取甜茶总黄酮得率的单因素试验。提取液于4 500 r/min离心分离6 min，收集上清液，用蒸馏水清洗沉淀，离心分离2次收集上清液，将上清液定容于1 000 mL容量瓶中，测定甜茶总黄酮提取得率，找出最佳提取时间。

1.3.3 正交试验优化方法。

根据单因素试验结果，选择乙醇浓度、料液比、超声波功率、提取温度和提取时间为5个主要考察因素，每个因素设3个水平，采用L18（37）设计正交试验，正交试验因素和水平表如表1。以总黄酮提取得率为评价指标，进行正交试验优化。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对甜茶总黄酮提取得率的影响。

由图2可知，随着乙醇浓度的增大，甜茶总黄酮提取得率呈现先升高后降低的趋势，在乙醇浓度为60%时提取得率最大。这可能是由于甜茶中有其他醇溶性杂质，当乙醇浓度增大时，高浓度乙醇可以沉淀甜茶中的粗蛋白、寡糖和多糖等，这些被沉淀的物质可能夹杂或包裹一部分总黄酮，导致总黄酮提取得率下降。因此，选定最佳乙醇浓度为60%。

2.1.2 料液比对甜茶总黄酮提取得率的影响。

由图3可知，随着料液比不断增大，总黄酮提取得率先上升后略有下降，当甜茶粉质量与乙醇体积比为1∶35时，提取得率最大。这可能是由于甜茶粉质量与乙醇体积比在1∶20至1∶35时，适当加大溶剂体积，甜茶粉可以完全浸泡在溶剂中，甜茶粉总黄酮能够更加充分地溶解在溶剂中，总黄酮提取得率呈上升趋势;而之后继续将料液比增大，提取得率开始呈现缓慢下降趋势，这可能是由于随着料液比增大，溶剂也吸收一部分超声波，溶质分到的超声波相对减少，从而降低了细胞对超声波的吸收量，细胞被破碎得不够充分，导致部分总黄酮未被溶出而使提取得率下降。因此，选定最佳料液比为1∶35。

2.1.3 超声波功率对甜茶总黄酮提取得率的影响。

由图4可知，超声波功率由40 W上升至80 W时，甜茶总黄酮提取得率明显呈上升趋势，当大于80 W时，甜茶总黄酮提取得率降低。研究表明，在超声波辅助提取法中，利用超声波的强震动、高加速度、强空化效应和强搅拌作用促进细胞破裂，使甜茶总黄酮在较短时间内进入溶剂。超声波功率较低时，超声波对细胞的破碎程度不够显著，所以提取得率较低。而当超声波功率增大时，分子之间运动强度加剧，从而使甜茶总黄酮提取得率增大。但当超声波功率过大时，可能由于分子之间运动强度过于剧烈，导致甜茶中活性物质之间发生反应，从而使甜茶总黄酮受到破坏，所以超声波功率大于80 W时甜茶总黄酮提取得率出现下降现象。因此，选定最佳超声波功率为80 W。

2.1.4 提取温度对甜茶总黄酮提取得率的影响。

由图5可知，提取温度在30～50 ℃时，随着提取温度不断升高，甜茶总黄酮提取得率明显呈上升趋势，当温度达50 ℃时，提取得率最大。原因是随着温度升高，分子之间的运动速率加快，使得甜茶总黄酮溶解、扩散到溶剂中的速率也随之加快。较高温度还可增加细胞膜通透性，使甜茶中的总黄酮更容易渗透出来，从而提高了提取得率。而当温度高于50 ℃时，提取得率出现缓慢下降趋势，可能的原因是高温促进黄酮类化合物与其他物质之间发生化学反应，尤其是氧化还原反应，导致总黄酮损失而出现提取得率降低。因此，选定最佳提取温度为50 ℃。

2.1.5 提取时间对甜茶总黄酮提取得率的影响。

由图6可知，提取时间为25～55 min时，随着提取时间不断延长，甜茶总黄酮提取得率明显呈上升趋势，当提取时间达55 min时提取得率最大，而当提取时间继续延长时，提取得率呈现缓

慢下降的趋势。可能的原因是随着提取时间的延长，超声波和温度共同作用促使黄酮类化合物与其他物质之间发生化学反应，尤其是氧化还原反应，导致总黄酮损失而出现提取得率缓慢降低。因此，选定最佳提取时间为55 min。

2.2 正交试验结果与分析

由表2可知，影响甜茶总黄酮提取得率的主次因素依次为料液比、超声波功率、提取温度、乙醇浓度、提取时间，最优方案为A2B2C2D3E 即乙醇浓度60%、料液比1∶35、超声波功率80 W、提取温度60 ℃、提取时间65 min。正交表中有该试验工艺组合，且该试验工艺组合的提取得率7.41%大于正交表中的其他工艺组合，因此确定该工艺组合为最优工艺组合。

3 结论

影响甜茶总黄酮提取得率的主次因素依次为料液比、超声波功率、提取温度、乙醇浓度、提取时间，甜茶中总黄酮超声波-乙醇提取法的最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶35、超声波功率80 W、提取温度60 ℃、提取时间65 min。此条件下，甜茶中总黄酮提取得率为7.41%。

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