高温饲养条件下蛋鸡卵巢组织的差异mRNAs筛选分析

康恺 李光辉 孙晨雨 效梅 安立龙 吴江

摘要 环境热应激是制约我国南方地区集约化家禽养殖业发展的一个重要因素，持续高温使蛋鸡出现产蛋率和蛋品质下降等问题，高温热应激是蛋鸡产业发展不能忽视的重要问题。该试验研究常温对照组和高温热应激组成年蛋鸡卵巢组织的差异mRNAs表达谱。60只26周龄成年蛋鸡随机分为常温对照组和高温热应激组，30 d后2组分别随机选用3只共6只采集卵巢組织制备HE染色组织切片并利用深度测序技术分析mRNAs差异表达谱。相比对照组，高温组组织切片中卵泡的内容物增多，着色加深，卵泡壁增厚。测序数据统计分析发现，热应激处理后相比常温对照组有146个mRNAs表达水平差异显著（P<0.05），77个上调表达、69个下调表达;对表达差异基因功能分析发现，其中显著性差异（P<0.05）的调控通路有维生素B6代谢、卵母细胞减数分裂、柠檬酸代谢和细胞周期。以上研究结果为进一步解析蛋鸡卵巢热应激、提高蛋鸡生产性能奠定了基础。

关键词 热应激;卵巢;差异mRNAs;蛋鸡

中图分类号 S831文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）20-0106-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening and Analysis of Differentially Expressed mRNAs in Ovarian Tissue of Laying Hens under High Temperature

KANG Kai，LI Guang hui，SUN Chen yu et al

（College of Agriculture，Guangdong Ocean University，Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract The heat stress caused by continuous high temperature weather has become an important restricting factor in the poultry industry. So， in this study， the differential expression profile of mRNAs in ovarian tissue of laying hens were investigated in normal temperature group and high temperature group. 60 adult laying hens with 26 weeks old were randomly divided into two groups， fed a same diet for 30 days respectively.Then the ovarian tissue of 6 hens from the three groups （3 from one group randomly） was collected to prepare HE stained tissue sections and be analyzed differential expression profiles of mRNAs by deep sequencing. In the section of ovarian tissue， compared with the control group， the contents of follicles were increased， the color was deepened， and the follicular wall was thickened in the high temperature group. The statistical analysis of sequencing data found that there were 146 mRNAs with the significant difference expression level （P<0.05） in high temperature group compared with the normal control group; the function analysis of difference expressed mRNAs found that the regulation pathways related to the heat stress were vitamin B6 metabolism， oocyte meiosis， citrate cycle and cell cycle.This research provided a foundation for further analyzing ovarian heat stress and improving performance of laying hens.

Key words Heat stress;Ovary;Differentially expressed mRNAs;Laying hens

环境热应激是我国南方地区蛋鸡集约化饲养面临的严峻挑战，每年的高温梅雨季节都影响蛋鸡群的产蛋率，夏季高温气候更是对全国的商品蛋产业产生深远影响[1]。持续高温使蛋鸡出现采食量、产蛋率和蛋品质下降等问题，严重时可引起蛋鸡死亡[2]，因此高温热应激是蛋鸡产业发展不能忽视的重要问题。

热应激可改变卵泡动力学和颗粒细胞功能，可能导致动物在夏季的生殖效率下降。热应激卵巢的TUNEL阳性颗粒细胞与HSP70、Bim和cleaved Caspase-3蛋白显著升高同时存在，而闭锁卵泡和颗粒细胞凋亡数量增加，这可能是热应激动物生育力下降的常见原因[3]。热应激也可抑制卵泡发育，通过凋亡影响卵泡的发育和分化[4]。研究表明日循环高温显著抑制蛋鸡卵泡发育，表现为产蛋数量下降、卵巢重量降低、大卵泡数量减少，而提高培养温度可显著增加颗粒细胞中活性氧（ROS）的产生量，同时抑制颗粒细胞的增殖活性[5]，但热应激损伤机制及其调控基因仍需进一步研究。

该研究利用人工控制环境模拟蛋鸡饲养热应激条件，控制环境温湿度，连续饲养30 d后采集蛋鸡卵巢组织，利用二代深度测序技术分析组织差异mRNAs表达谱，以期为深入阐述热应激造成蛋鸡卵巢组织损伤的机制和候选调控基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

罗曼粉壳蛋鸡鸡苗购于广东喜迎珍禽有限公司，饲养于广东海洋大学动物医院动物房。蛋鸡育成及饲养管理参照 Lohmann Tierzucht GmbH 手册（https：//www.ltz.de/en/downloads/management guides.）。姜黄素购于西安金绿生物工程技术有限公司，纯度>97%（批号：BW2017010A）。

1.2 仪器和试剂

低温高速离心机（Sigma）、普通离心机（Sigma）、电子分析天平（Shimadzu）、电热鼓风干燥箱（广州吉迪）、IX53型倒置显微镜（Olympus）、切片机（Leica）、电动研磨棒（TianGen）。多聚甲醛、乙醇、异丙醇、氯仿等试剂均为国产分析纯产品。

1.3 试验动物分组与样品采集

挑选产蛋率、体重相近的26周龄蛋鸡60只，随机分为2组，对照组（CK）和热应激组（HC）各30只，采用三层阶梯式笼养，每笼2只。控制常温对照组温度为（25±1）℃，湿度65%～75%;高温组每天10：00—16：00控制温度为（32±1）℃，其余时间温度与常温对照组相同。对照组和高温组饲喂实验室通用基础日粮[6]，定时投料，自由采食和饮水，每天18：00清粪，光照时间为16 h/d，光照强度为10～15 lx，定期免疫。

连续饲养30 d，每天18：30收集当天产鸡蛋，分别计算2组蛋鸡的平均产蛋率，30 d后2组分别随机选用蛋鸡3只，共6只，取卵巢组织于2 mL RNase-free离心管中置-80 ℃保存备用。

1.4 组织切片HE染色

取样品切成大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小组织块放于4%PFA（多聚甲醛）固定液中固定（固定液的体积为组织块的15～20倍），固定24 h;再经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（5 μm）、展片、烘干、水洗、HE染色，最后用中性树胶封片，贴上标签并编号，显微镜下观察并拍照。

1.5 样品测序及数据分析

样品送杭州联川生物有限公司测序分析，采用去除rRNA的建库方式进行测序分析，检测各样品中不同mRNAs的表达水平。首先利用Cutadapt[7]软件剔除测序数据中的测序载体、低质量和不能识别的碱基信号等干扰信息，获得可进一步分析的高质量原始测序数据。再用Bowtie2[8]和TopHat2[9]将测序数据与鸡的基因组序列信息比对后装配出样品的转录组序列信息数据，最后利用StringTie[10]和Ballgown[11]软件计算所有mRNAs的表达水平。

差异mRNAs表达的数据筛选，首先利用StringTie[10]软件计算各mRNAs的FPKM值，再利用R软件包Ballgown[11]筛选差异mRNAs，筛选条件为log2（fold change）>1或者log2（fold change）<-1并且统计学差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 高温饲养条件对蛋鸡产蛋率和卵巢组织结构的影响

连续饲养30 d，每天收集当天产鸡蛋，分别计算2组蛋鸡的平均产蛋率，对照组平均产蛋率为88.91%，高温组平均产蛋率为81.34%，2组数据比较差异显著（P<0.05），高温饲养条件下蛋鸡产蛋率显著下降。

采集对照组和高温组蛋鸡卵巢组织，制备石蜡切片进行HE染色后光学显微镜观察。在对照组卵巢切片中，卵泡内容物着色浅（图1A）;而在高温组卵巢切片中，卵泡内容物着色点增多、着色加深，卵泡壁增厚明显，同样处理程序制备的切片中高温组的中小卵泡多呈不规则环形（图1B）。高温饲养条件下蛋鸡卵巢中卵泡组织结构出现异常。

2.2 mRNAs差异表达谱分析

由mRNAs在2組样品中的差异表达分析可知，在高温应激组中表达差异显著（P<0.05）的基因数目分别是77个上调表达、69个下调表达。对差异表达的mRNAs表达量分析，上调和下调的前20个基因如表1、2所示。

2.3 差异表达mRNAs基因功能注释与分析

对差异表达mRNAs进行功能注释分析发现，在GO数据库中可以极显著（P<0.01）富集的功能群，分子功能群（molecular_function，MF）有8个，生物学过程群（biological_process，BP）有16个，细胞组分群（cellular_component，CC）有4个，相关的差异表达mRNAs有63个（表3）。

在KEGG数据库中可以富集（P<0.05）的通路（表4）有维生素B6代谢、卵母细胞减数分裂、柠檬酸代谢（三羧酸循环）和细胞周期（编号分别是ko00750、ko04114、ko00020和ko04110），相关的差异表达mRNAs有11个。

3 讨论

3.1 高温饲养条件影响蛋鸡的产蛋率和卵巢组织结构

全球变暖是一种主要的压力环境状况，体温升高到生理恒温点以上（热应激），从而影响动物的繁殖效率，热应激对生殖功能的损伤涉及受精过程以及胚胎到胎儿发育的早晚期等阶段，这种情况对牲畜造成了巨大的经济损失[12]。试验中可见高温饲养条件下蛋鸡产蛋率显著下降。由于家禽具有羽毛丰厚、皮肤无汗腺、代谢旺盛、体温高等特点，其生产性能极易受到环境温度的影响，高温一直是影响家禽养殖的一个重要因素[13]。在高温组卵巢切片中可见卵泡内容物着色点增多，着色加深，卵泡壁增厚明显，同样处理程序制备的切片中高温组的中小卵泡多呈不规则环形。高温饲养条件下蛋

鸡卵巢中卵泡组织结构出现异常，可见在高温应激组中，原始卵泡的比例下降，这提示在热应激条件下饲养蛋鸡，影响卵巢功能，抑制卵泡发育。热应激影响蛋鸡的生长速度、产蛋量和生育力，环境温度过高是影响热带和亚热带国家家禽生产经济和生物效率的一个严重问题，随着全球气候变化，这一问题预计将变得更加突出，这些负面影响造成了巨大的经济损失[14]。

3.2 高温饲养条件下蛋鸡卵巢组织差异mRNAs的通路分析

差异mRNAs在KEGG数据库中可以富集（P<0.05）的通路有维生素B6代谢、卵母细胞减数分裂、柠檬酸代谢（三羧酸循环）和细胞周期。以上4个通路与卵子发生、卵泡发育均有密切关系。

减数分裂过程需要与周期蛋白依赖激酶（CDKs）相关的特定周期蛋白参与，以确保DNA复制的保真度，不同细胞周期蛋白在减数分裂中具有不同的特异性调控[15]。在卵母细胞减数分裂周期的不同阶段，有几种直接或间接诱导凋亡的分子[16]。热应激破坏牛卵母细胞的缝隙连接和卵丘功能，卵丘细胞与卵母细胞之间以及卵母细胞之间的密切联系对卵母细胞减数分裂的停止和恢复起着重要的调节作用，热应激影响卵丘细胞通讯和功能，进而影响卵母细胞减数分裂的进程[17]。卵母细胞与颗粒细胞之间的细胞间通讯对正常卵泡分化和卵母细胞发育至关重要，卵母细胞调节颗粒细胞内糖酵解和TCA循环的方式与颗粒细胞的数量和卵母细胞的生长发育阶段有关，卵母细胞通过调节编码糖酵解酶的基因表达水平来控制颗粒细胞的糖酵解，卵丘细胞与卵母细胞之间的代谢协同性是颗粒细胞产生能量、卵母细胞与卵泡发育所必需的[18]。研究表明能量分子通过线粒体代谢产生足够的ATP与卵母细胞质量之间存在联系，其中脂肪酸一旦进入线粒体基质就被分解成乙酰辅酶a分子，乙酰辅酶a分子通过TCA循环和电子传递链进一步代谢产生ATP[19]。

母体B族维生素水平可影响生育和妊娠的建立，并可以直接影响卵泡和卵母细胞的发育，研究发现在卵泡刺激素（FSH）作用下限制成年母羊日粮中维生素B12的供应影响卵泡的发育[20]。吡啶是维生素B6的催化活性形式，在多种细胞过程中起着至关重要的作用，吡哆醇提高了囊胚率和孵化率，体外受精过程中，吡哆醇通过增加胚胎总细胞数、降低CTSB mRNA表达和凋亡率，也显著提高了胚胎的质量，可见体外受精过程中添加吡啶是提高牛卵母细胞发育能力和胚胎质量的有效手段[21]。

可见，热应激有多种可能的作用机制，通过影响以上4种通路进而造成蛋鸡卵巢损伤、降低产蛋率。

4 结论

热应激造成蛋鸡卵巢损伤，常温组和高温组蛋鸡卵巢组织mRNAs表达谱组间差异表达的共有146个，差异mRNAs基因功能分析与热应激过程密切相关的调控通路有维生素B6代谢、卵母细胞减数分裂、柠檬酸代谢（三羧酸循环）和细胞周期共4个。该研究筛选的一批候选基因为进一步解析蛋鸡卵巢热应激的损伤机制提供了重要参考。

参考文献

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