肤康凝胶微生物限度检查方法适用性试验的研究

甘灿云 陈海红 杨海燕

[摘要]目的 建立膚康凝胶适宜的微生物限度检查方法。方法 按照《中国药典》2015年版4部通则1105、1106、1107，分别采用常规法、培养基稀释法对肤康凝胶进行微生物限度检查方法学验证，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌的回收率为指标，考察需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法;建立控制菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检查方法。结果 常规平皿法需氧菌总数计数显示，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收率较低，不在药典规定的0.5～2.0范围内，不符合要求;培养基稀释法需氧菌总数计数显示，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合要求。采用平皿法和培养基稀释法霉菌和酵母菌总数计数白色念珠菌和黑曲霉的平均回收率在药典规定的0.5～2.0范围内，均符合要求。采用常规法供试液组和阴性组均未检出两种控制菌，试验组金黄色葡萄球菌未被检出，铜绿假单胞菌能被检出，存在抑菌干扰，方法不可行;采用培养基稀释法试验组铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均能被检出，供试液组和阴性对照组两种试验菌均显示阴性，无干扰，方法可行。三批样品验证结果需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数均符合标准规定，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均未检出。结论 肤康凝胶可用培养基稀释法进行微生物限度检查。

[关键词]肤康凝胶;微生物限度检查;回收率;方法验证

[中图分类号] R286          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）9（c）-0017-05

[Abstract] Objective To establish a suitable microbial limit test method for Fukang Gel. Methods According to the 4 general principles 1105， 1106， and 1107 of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition， routine method and medium dilution method were used respectively to verify the microbial limit test of Fukang Gel. The recovery rates of five test bacteria， Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were used as indicators， the total number of Aerobic bacteria， Fungi and Yeasts was investigated， and the detection methods of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were established. Results The total number of Aerobic bacteria counted by conventional plate method showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were low， which were not in the range of 0.5-2.0 stipulated in the Pharmacopoeia and did not meet the requirements. The total number of Aerobic bacteria counted by medium dilution method showed that the recovery rates of Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger all met the requirements. The average recoveries of Candida albicans and Aspergillus niger counted by the total number of fungi and yeasts by plate method and medium dilution method were within the range of 0.5-2.0 prescribed in the Pharmacopoeia， which met the requirements. Two kinds of control bacteria were not detected in the test solution group and negative group by routine method. Staphylococcus aureus was not detected in the test group， Pseudomonas aeruginosa could be detected， and there was interference of bacteriostasis， so the method was not feasible. Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus could be detected in the test group by medium dilution method. Both the test solution group and the negative control group showed negative， no interference， and the method was feasible. The results of three batches of samples validation showed that the total number of Aerobic bacteria， Fungi and Yeasts were in accordance with the standard， but Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were not detected. Conclusion Fukang Gel can be used for microbial limit test by medium dilution method.

[Key words] Fukang Gel; Microbial limit test; Recovery rate; Methods validation

复方苦参洗剂是我院特色中药制剂，具有清热解毒、燥湿止痒的功效，主治湿疹、皮肤脓疱疮及红痱等引起的瘙痒性、感染性皮肤病[1]，疗效显著，广泛应用于临床，深受患者青睐。由皮肤科省级名中医邬成霖主任医师在中医古方“苦参汤””的基础上精心组方，研制而成，肤康凝胶则是复方苦参洗剂经工艺剂型改造制成的外用凝胶剂。药品中的微生物污染可直接影响药品质量稳定性和引发不良反应，因此微生物限度检查是药品安全性研究的重要組成部分[2]，控制药品中的微生物是确保药品质量、保障药品安全的重要措施，检查方法随药典的变化而更新，医院制剂的质量标准也随之更新。从2005版《中国药典》开始提出药品微生物限度要进行方法学验证，到2015版《中国药典》对微生物限度检查的培养基适应性、实验环境要求、方法适应性等方面进行修订，是对药品微生物检查重视性的极大提高，使检验结果更严谨准确，并与国际标准接轨[3]。由于中药制剂成分多样，有些抑菌作用的成分可能影响到微生物限度检查结果的准确性，通过方法适用性试验来确定检验方法的可行性和有效性是十分有必要的[2]。本研究选取3批肤康凝胶，按2015版《中国药典》四部通则1105、1106、1107非无菌产品微生物限度检查[4]，参考相关文献报道的凝胶剂微生物限度检查方法[5-8]，进行微生物限度适用性试验，建立可靠的检验方法，保证药品的质量，为相关制剂的微生物限度检查提供参考，现报道如下。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验药物  肤康凝胶30 g/支（批号：190320， 190321，190322），由杭州市中医院制剂室提供。

1.1.2试验菌种  金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，批号：CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[Bacillus Sulticis，批号：CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa，批号：CMCC（B）10104]、白色念珠菌[Candida albicans，批号：CMCC（F）98001]、黑曲霉[Aspergillus niger，批号：CMCC（F）98003]，以上菌种均来自中国食品药品检验研究院，为第三代菌种。

1.1.3试验用培养基及试剂  胰酪大豆胨液体培养基（批号：170711）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1802062）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1801102）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：180228）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：170103）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：170509），pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1701033），所有培养基适用性检查均合格，按说明配制，厂家均为北京三药科技开发公司。氯化钙、0.9%无菌氯化钠溶液（自配）。

1.1.4试验仪器  GR60DA型立式自动压力蒸汽灭菌器（厦门致微仪器有限公司）、DHG9246A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、DK-600型电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）、HTY-761型匀浆仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）、BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）、SJ-CJ-2FD超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、LRH系列生化培养箱（上海和呈仪器制造有限公司）、HSX系列霉菌培养箱（上海和呈仪器制造有限公司）。

1.2方法

1.2.1菌液制备方法  ①取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接种至10 ml胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养18 h后，将上述培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液依次10倍稀释，计数至每1 ml中含菌数为100～1000 cfu的菌悬液，备用。②取枯草芽孢杆菌接种至胰酪大豆胨琼脂斜面，35℃培养24 h后，用0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，用0.9%无菌氯化钠溶液依10倍稀释，计数至每1 ml含菌数为100～1000 cfu的菌悬液，备用。③取白色念珠菌接种至10 ml沙氏葡萄糖液体培养基中，25℃培养48 h后，将上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液依次10倍稀释，计数至每1 ml含菌数为100～1000 cfu的菌悬液，备用。④取黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面，25℃培养5 d，用5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，再用无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液依次10倍稀释，计数至每1 ml中含孢子数100～1000 cfu的孢子悬液，备用。

1.2.2供试液的制备方法  取肤康凝胶10 g，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80 ml，匀浆使其溶解，再加入10%无菌氯化钙溶液10 ml，摇匀，静置数分钟，所得上清液为1∶10供试液，备用。

1.2.3需氧菌总数和霉菌酵母菌总数常规法计数  ①试验组计数方法具体如下。a.需氧菌总数：取5支1∶10的供试液9.9 ml，分别加入每1 ml含菌数100～1000 cfu的各试验菌0.1 ml，混匀。立即取含菌供试液1 ml，置于直径90 mm的无菌平皿中，注入胰酪大豆胨琼脂培养基，每种试验菌平行制备2个平皿，于33℃倒置培养3 d，计菌落数。b.霉菌和酵母菌总数：取2支1∶10供试液9.9 ml，分别加入每1 ml含菌数100～1000 cfu的各试验菌0.1 ml，混匀。取含菌供试液1 ml，置于直径90 mm的无菌平皿中，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，每种试验菌平行制备2个平皿，于23℃倒置培养5 d，计菌落数。②供试品对照组：按试验组计数方法，以稀释剂代替菌液，测定供试品本底菌数。③菌液对照组：按试验组计数方法，采用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，测定菌数。

1.2.4需氧菌总数和霉菌酵母菌总数培养基稀释法计数  ①试验组计数方法具体如下。a.试验组需氧菌总数：取5支1∶10的供试液9.9 ml，分别加入每1 ml含菌数100～1000 cfu的各试验菌0.1 ml，混匀。立即取含菌供试液1 ml，置于直径90 mm的无菌平皿中，每皿0.2 ml，注入胰酪大豆胨琼脂培养基，于33℃倒置培养3 d，计菌落数。b.霉菌和酵母菌总数：取2支1∶10供试液9.9 ml，分别加入每1 ml含菌数100～1000 cfu的各试验菌0.1 ml，混匀。取含菌供试液1 ml，置于直径90 mm的无菌平皿中，每皿0.2 ml，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，于23℃倒置培养5 d，计菌落数。②供试品对照组按试验组计数方法，以稀释剂代替菌液，测定供试品本底菌数。③菌液对照组按试验组计数方法，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，测定菌数。

1.2.5回收率计算方法  各菌株回收率=（试验组平均菌落数﹣供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数。回收率在药典规定0.5～2.0范围内，提示该方法可用于供试品需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的计数检查，若有试验菌回收率不在规定范围内，则需进一步用适宜的方法进行试验。

1.2.6控制菌检查方法适用性试验常规法  ①试验组控制菌检查方法适用性试验具体如下。a.金黄色葡萄球菌检查：取1∶10供试液10 ml，加至100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入1 ml含10～100 cfu金黄色葡萄球菌，33℃培养18 h，取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，33℃培养18 h，观察结果。b.铜绿假单胞菌检查：取1∶10供试液10 ml，加至100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养18 h，取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，33℃培养18 h，观察结果。②供试品溶液组取1∶10供试液10 ml，加至100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组，观察培养结果。③阳性对照组取相应菌液各1 ml，分别接种于100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，检查方法同试验组。④阴性对照组取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液10 ml直接加至100 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组，观察培养结果。

1.2.7控制菌检查方法适用性试验培养基稀释法  ①试验组控制菌检查方法适用性试验具体如下。a.金黄色葡萄球菌检查：取1∶10供试液10 ml，加至200 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入1 ml含10～100 cfu金黄色葡萄球菌，33℃培养18 h，取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板上，33℃培养18 h，观察结果。b.铜绿假单胞菌检查：取1∶10供试液10 ml，加至200 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养18 h，取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，33℃培养18 h，观察结果。②供试品溶液组取1∶10供试液10 ml，加至200 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组，观察培养结果。③阳性对照组取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液10 ml，各菌液1 ml，分别接种于200 ml胰酪大豆胨液体培养基中，检查方法同试验组。④阴性对照组取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液10 ml直接加至200 ml的胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组，观察培养结果。

1.2.8三批凝膠微生物限度检查  根据2015版药典制剂通则凝胶剂的质量要求及非无菌产品微生物限度检查法，需氧菌总数限度为102 cfu/g，霉菌和酵母菌总数限度为10 cfu/g，每1 g样品中不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

2结果

2.1计数方法适用性试验结果

2.1.1需氧菌总数计数的平均回收率  常规平皿法需氧菌总数计数显示，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收率较低，不在药典规定的0.5～2.0范围内，不符合要求;培养基稀释法需氧菌总数计数显示，5种试验菌回收率均符合要求（表1）。

2.1.2霉菌和酵母菌总数计数的平均回收率  采用平皿法和培养基稀释法霉菌和酵母菌总数计数白色念珠菌和黑曲霉的平均回收率在药典规定的0.5～2.0范围内，均符合要求（表2）。

2.2控制菌检查方法适用性试验结果

采用常规法供试液组和阴性组均未检出两种控制菌，试验组金黄色葡萄球菌未被检出，铜绿假单胞菌能被检出，存在抑菌干扰，方法不可行（表3）;采用培养基稀释法试验组铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均能被检出，供试液组和阴性对照组两种试验菌均显示阴性，无干扰，方法可行（表4）。

2.3三批凝胶微生物限度检查结果

需氧菌总数和霉菌酵母菌总数均符合标准规定，控制菌金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞球菌均未检出（表5）。

3讨论

医院制剂的可持续发展受制剂产品质量的制约，并与临床疗效和用药安全关系密切[9]。控制医院制剂微生物限度是确保医院制剂质量的关键环节。随着药品微生物限度标准与国际接轨，检查方法不断完善和提高，微生物限度适用性试验为药品微生物检验提供了适宜的参考依据和科学可行的标准，确认采用的方法在无抑菌作用下保证供试品中含有的微生物能被检出，从而提高中药制剂使用的安全性和有效性[10]。

中药制剂中所含的成分和不同的浓度对微生物有一定的抑制和杀灭作用，肤康凝胶是一种主要成分为苦参碱、黄芩苷、小檗碱等抑菌成分的外用制剂，据文献报道黄芩苷等对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌作用[11]，可能会出现检验结果的假阴性，影响该制剂微生物限度检查的准确性。因此，要确定该制剂的检验方法，提高污染微生物的检出率，需采用适宜的方法消除自身抑菌作用的干扰，进行微生物适用性试验[12-13]。微生物适用性试验开展的一般策略为先平皿法[14]，后薄膜过滤法，从最低稀释级开始，选择适宜的稀释级。与2010版《中国药典》相比采用验证的试验菌有所不同，为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌，菌液在供试品溶液制备过程中就直接加入混匀，所加菌液不超过供试液的1%[15]，加菌时机提前，更能模拟样品污染状态，更真实地反映样品的染菌情况[16]。如药品有抑菌活性，消除样品抑菌性的主要技术手段为增大稀释液或培养基稀释法、加入中和剂或灭活剂、薄膜过滤法或上述几种方法的联合使用[17-18]。若药物成分抑菌作用较弱，采用培养基稀释法可符合试验要求[19];薄膜过滤法虽可直接过滤抑菌成分，但不适用于非完全溶解的供试品。本试验药品为中药凝胶，加入稀释液后并未完全溶解，需加入氯化钙溶液破胶，取上清液作为供试品，上清液看似溶液状态但含细小的不溶性药物，会堵塞滤膜[20]，2015版药典供试品处理已取消离心法，故采用常规法和培养基稀释法进行实验分析，结果显示，采用常规平皿法进行需氧菌总数计数试验时，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收率较低，且显著<0.5，控制菌检查试验组中的金黄色葡萄球菌未被检出，可能与其中抑菌性成分的作用有关，因此常规法无法准确检出药品是否被污染，不符合要求;采用培养基稀释法，各试验菌的回收率相比常规法都有提高，且回收率均>0.7，在药典规定的最短时间内，控制菌均能被检出，可消除肤康凝胶的抑菌活性，符合药典规定。

本试验对肤康凝胶进行微生物限度方法适用性研究，最终确定该凝胶的检查方法为：取10 g肤康凝胶，加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80 ml，匀浆使其溶解，再加入10%无菌氯化钙溶液10 ml，摇匀，静置数分钟，所得上清液为1∶10的供试液。需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数取1∶10供试液1 ml，采用培养基稀释法检查，每培养皿0.2 ml。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查，取1∶10供试液10 ml，加入胰酪大豆胨液体培养基中，培养基用量均为200 ml，方法可靠，适合作为肤康凝胶微生物限度检查方法。

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（收稿日期：2019-07-11  本文编辑：刘克明）