肉苁蓉高压蒸制工艺的优化

刘博男，史 辑，贾天柱，吕彤彤，李 喆

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600）

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效［1-2］，主要用于抗疲劳、抗衰老、调节免疫等，对帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病有显著疗效［3］，主要成分为苯乙醇苷、生物碱等［4］。肉苁蓉炮制历史悠久，最早见于南北朝的《雷公炮炙论》，之后历代文献记载的炮制方法以酒制为主，包括酒洗、酒炒、酒蒸焙、酒浸、酒焙干等［5-6］，《中国药典》 规定为酒炖和酒蒸，但两者既耗费时间人力，又会使有效成分损失严重，而高压蒸制法由于其操作简便可控，成为近年来研究热点［7］，但主要影响因素及评价指标缺乏系统考察，故对其进行优化以确保饮片质量与临床疗效很有必要［8］。本实验采用正交试验优化肉苁蓉高压蒸制工艺，为建立该药材省时高效的炮制方法提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 Acquity H-Class UPLC 色谱仪（美国Waters 公司）；KQ-250DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AE240电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；YXQLS-18 S1不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器［9］。

1.2 试药 肉苁蓉购自内蒙古王爷地苁蓉有限公司，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 干燥带鳞叶的肉质茎。松果菊苷（批号MUST-13080801，含有量≥98%）、异类叶升麻苷（批号MUST-15081001，含有量≥99.77%）对照品由成都曼斯特生物有限公司提供；毛蕊花糖苷（批号O0618AS，含有量≥98%）、2′-乙酰基毛蕊花糖苷（批号M0601AS，含有量≥98%）对照品由美仑生物有限公司提供。甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 含有量测定

2.1.1 对照品溶液制备［2］精密称定对照品松果菊苷4.90 mg、毛蕊花糖苷4.70 mg、异类叶升麻苷5.05 mg、2′-乙酰基毛蕊花糖苷4.85 mg，置于5 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取不同炮制方法制成的药材粉末（过4号筛）各1 g，置于100 mL棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定质量，浸泡30 min 后超声40 min，冷却至室温，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得［2］。

2.1.3 色谱条件［10］ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm × 50 mm 1.7 μm）；体积流量0.4 mL／min；流动相甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0～3.5 min，10%～25% A；3.5～7.5 min，25%～35% A；7.5～11.5 min，35%～38%A；11.5～12 min，38%～100%A；12～14 min，100%A）；进样量1 μL。色谱图见图1。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 线性关系考察 取对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μL，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定6次，测得松果菊苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为0.18%、0.20%、0.30%、0.46%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.3”项色谱条件下进样，测得松果菊苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为0.15%、0.24%、0.41%、1.42%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密称取同一批药材6份，每份1 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样，测得松果菊苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷峰面积RSD 分别为1.78%、0.83%、1.47%、2.95%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取含有量已知的药材细粉6份，每份1 g，按照1 ∶1比例加入对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样，计算回收率。结果，松果菊苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为100.1%、100.3%、99.9%、99.8%，RSD 分别为0.3%、1.2%、0.2%、1.1%。

2.2 单因素试验

2.2.1 评价指标确定 2015年版《中国药典》 中肉苁蓉指标成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷，而且炮制后前者含有量约为后者4倍；课题组前期发现，异类叶升麻苷炮制后含有量明显升高，并且毛蕊花糖苷和2′-乙酰基毛蕊花糖苷有转换关系。因此，本实验以综合评分OD 值（Y）为评价指标（Y=0.4A／Amax＋0.1B／Bmax＋0.4C／Cmax＋0.1D／Dmax，其中A～D分别为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷含有量，Amax～Dmax分别为各成分对应的最高含有量）。

2.2.2 闷润时间 取药材6份，按1 ∶1比例加黄酒闷润3、4、5、6、7、8 h，在0.15 MPa 压力下蒸制4 h，取出后70 ℃下烘干，重复3次，取平均值，结果见图2，可知闷润时间6 h 时OD 值最高。

2.2.3 加酒量 取药材5份，按1 ∶0.3、1 ∶0.5、1 ∶0.7、1 ∶0.9、1 ∶1.1比例加黄酒闷润6 h，在0.15 MPa 压力下蒸制4 h，取出后70 ℃下烘干，重复3次，取平均值，结果见图3，可知加酒量1 ∶0.5时OD 值最高。

图2 闷润时间对OD 值的影响Fig.2 Effect of moistening time on OD value

图3 加酒量对OD 值的影响Fig.3 Effect of wine addition on OD value

2.2.4 干燥温度 取药材5份，按1 ∶1比例加黄酒闷润6 h，在0.15 MPa 压力下蒸制4 h，取出后40、50、60、70、80 ℃下烘干，重复3次，取平均值，结果见图4，可知干燥温度对OD 值无明显影响。

图4 干燥温度对OD 值的影响Fig.4 Effect of drying temperature on OD value

2.2.5 蒸制时间 取药材5份，按1 ∶1比例加黄酒闷润6 h，在0.15 MPa 压力下蒸制2、3、4、5、6 h，取出后70 ℃下烘干，重复3次，取平均值，结果见图5，可知蒸制时间4 h 时OD 值最高。

2.2.6 蒸制压力 取药材3份，按1 ∶1例加黄酒闷润6 h，在0.05、0.10、0.15 MPa 压力下蒸制4 h，取出后70 ℃下烘干，重复3次，取平均值，结果见图6，可知蒸制压力0.05时OD 值最高。

图5 蒸制时间对OD 值的影响Fig.5 Effect of steaming time on OD value

图6 蒸制压力对OD 值的影响Fig.6 Effect of steaming pressure on OD value

2.3 正交试验 取等量、大小均匀的药材9份，在单因素试验基础上，选择闷润时间（A）、加酒量（B）、蒸制时间（C）、蒸制压力（D）作为影响因素，OD 值作为评价指标，采用L9（34）正交表设计试验，因素水平见表2，结果见表3，方差分析见表4，可知蒸制压力（D）具有显著影响（P＜0.05）。由此确定，最优工艺为A1B1C1D1，即药材加30%黄酒闷润4 h 后，在0.025 MPa 压力下蒸制3 h。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

表3 试验设计与结果Tab.3 Design and results of tests

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

然后，取3份药材，每份30 g，按优化工艺进行3批验证试验。药材打粉后按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测 定，结果见表 5，可知工艺稳定可 行（RSD=0.97%）。

表5 验证试验结果（n=3）Tab.5 Results of verification tests（n=3）

3 讨论

肉苁蓉中主要含有苯乙醇苷、生物碱等活性成分，其中前者具有提高机体免疫［11］、保护神经元［12］、减少自由基生成、抗脂质过氧化作用［13］。2015年版《中国药典》 中肉苁蓉指标成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷；课题组前期发现，异类叶升麻苷炮制后含有量有所升高，毛蕊花糖苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷有转换关系，故本实验选择这4种成分含有量作为评价指标。

肉苁蓉传统炮制方法耗时耗能，一般闷润8 h后常压蒸制15 h；本实验优化其高压蒸制工艺，只需加30%黄酒闷润4 h 后于0.025 MPa 压力下蒸制3 h 即可，大大缩短了工时，并且避免该药材长时间蒸制时有效成分的流失。另外，验证试验结果显示该工艺重复性较好，具有一定的可行性。