微囊藻毒素对水稻幼苗营养吸收的影响

刘洪月，申泽辉，梁婵娟*

（1.江苏省厌氧生物技术重点实验室，江南大学环境与土木工程学院，江苏 无锡214122；2.江苏省水处理技术与材料协同创新中心，江苏 无锡214122）

近年来，我国许多大型淡水湖泊和水库中蓝藻水华爆发频繁，蓝藻细胞衰亡后会产生多种毒素[1]。其中，微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是出现频率最高、产量最大和危害最严重的一类藻毒素[2]。MCs通过灌溉等方式进入农田生态系统，直接影响农作物生长和粮食生产。在灌溉水中，MCs浓度通常超过世界卫生组织（WHO）允许的标准值1 μg·L-1，常见浓度范围为4～50 μg·L-1，在蓝藻大量死亡的极端情况下甚至高达6500 μg·L-1[3]。近年来，许多研究报道了MCs 对陆地植物的影响，包括抑制种子萌发、损害组织发育和降低作物产量[4-5]，涉及机理集中在抑制蛋白磷酸酶活性[6]、氧化应激和降低光合作用等方面[7]。本项目组前期研究表明低浓度MCs（1 μg·L-1）促进了水稻幼苗的生长，与提高PSⅡ的光化学活性和光合电子传递及增加叶绿素含量有关。高浓度MCs（≥1000 μg·L-1）对水稻幼苗的生长造成不可逆伤害，与膜脂过氧化和光合功能受损有关[8-10]。而植物中光合系统和抗氧化系统氧化与营养元素的吸收、分布和转运密切相关[11]。质膜H+-ATP 酶是植物营养吸收的主宰酶，通过水解ATP 产生能量将H+泵出细胞，在细胞膜两侧形成的质子驱动势，为营养元素跨膜运输提供原初动力[12]。然而目前鲜有关于MCs 对植物营养吸收的影响及其内在机制的报道。水稻作为第一大粮食作物，其用水量大，较其他作物更易受MCs 污染的影响[13]。因此本研究以水稻为试材，以质膜H+-ATP 酶为切入点，结合根系活力和ATP 含量的变化，探究MCs 对植物营养吸收的影响。本文研究结果不仅为丰富MCs对植物的致毒机理提供新的佐证材料，而且为减轻MCs对植物造成的伤害提供新的思考方向。

1 材料与方法

1.1 藻毒素的制备

从无锡太湖打捞站取新鲜蓝藻，将蓝藻烘干、制粉保存。称取1 g干燥的藻粉，加入40 mL 5%的冰乙酸，室温抽提2 h，8000 r·min-1离心10 min，沉淀用40 mL 5%冰乙酸继续抽提，重复2次，合并3次抽提的上清液，调节pH 为3.0，离心去除杂质蛋白，调节pH 为7.0，将粗提取液过Sep-pak C18 柱固相萃取（500 mg·6 mL-1，Waters corporation，美国）。采用高效液相色谱法（Ultimate 3000，Dionex corporation，美国）测定MCs 的组成，发现MC-LR、MC-RR 和MC-YR 有明显出峰，且峰值稳定。采用酶联免疫法ELISA（Microcystins plate kit，Beacon Analytical Systems Inc，Saco，ME）测量粗提液中MCs的浓度[8]。

1.2 试材培养

水稻（Oryza sativa）试验材料选择“淮稻8 号”。选择籽粒饱满的水稻种子用HgCl2（0.1%，W∕V）消毒10 min，洗涤3 次后在去离子水中浸泡8 h，置于恒温培养箱（25 ℃）中催芽3 d。将幼芽置于蛭石中培养至两叶一心时转移至周转箱（6.88 L）中水培。营养液采用常规营养液配方，其组分为150 mmol·L-1（NH4）2SO4、24 mmol·L-1KH2PO4、42 mmol·L-1K2SO4、120 mmol·L-1CaCl2·H2O、120 mmol·L-1MgSO4·7H2O、60 mmol·L-1Na2SiO3·9H2O、1.08 mmol·L-1MnCl2·4H2O、2.4 mmol·L-1H3BO3、2.40 mmol·L-1Fe（Ⅲ）-EDTA，46.82 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O、92.39 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、38.40 μmol·L-1CuSO4·5H2O[14]。营养液每3 d更新一次。待幼苗长至4叶1心（此时已结束返青，水稻生长旺盛，是营养生长的关键时期）时，进行MCs处理[15]。

1.3 试材处理

将高浓度藻粉粗提液用营养液分别稀释成不同MCs 浓度（1、10、100、1000 μg·L-1），以不含MCs 的营养液作为对照。将水稻幼苗在含有不同浓度MCs 的营养液中连续培养7 d（胁迫期），取样进行各指标的测定。将剩余水稻幼苗移至对照条件下培养7 d（恢复期），再取样测定。

1.4 指标测定

营养元素含量测定：用电感耦合等离子体发射光谱仪（Perkin Elmer Corp，Norwalk，CT，美国）测定钾（K+）、钠（Na+）、钙（Ca2+）、镁（Mg2+）、铁（Fe2+）、锌（Zn2+）、铜（Cu2+）含量[16]。PO3-4含量的测定用钼蓝比色法[17]；NH+4-N 含量的测定采用靓酚蓝法[18]；NO-3-N 含量的测定采用水杨酸法[19]。根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）脱氢酶法[20]。ATP含量用高效液相色谱仪（Ultimate 3000，Dionex corporation，美国）测定[17]。质膜H+-ATP酶活性的测定采用无机磷含量法[21]。于水稻幼苗根尖取样，用Trizol 试剂提取RNA，以反转录合成的cDNA 的第一链为模板，进行PCR 扩增循环。引物序列和扩增程序参照参考文献[17]。基因相对表达量采用2-△△CT法进行计算。每个处理重复3次，每次测定重复3次。

1.5 数据处理

所有数据均为3 次独立试验的平均值±标准差（Mean±SD）。试验数据采用SPSS 16.0和Origin 8.5软件进行统计分析和绘图，不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 MCs对水稻幼苗营养物质含量的影响

矿质营养元素参与细胞的组成、酶的活化和调控生理过程[22]。如表1 所示，胁迫7 d 后，1 μg·L-1MCs组水稻幼苗中矿质营养（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、PO34-、NO-3和NH+4）含量无显著变化。10 μg·L-1MCs 组水稻幼苗中Mg2+、Fe2+、Zn2+、NO-3和NH+4含量增加，PO3-4含量降低。推测原因如下：10 μg·L-1MCs 增强了矿质元素跨膜运输的驱动；植物中矿质元素的吸收与其转运通道及蛋白有关，因此10 μg·L-1MCs 处理还可能通过影响Mg、Fe、Zn和N转运蛋白家族的表达来增强植物对MCs胁迫的适应性[23-24]。Mg2+、Fe2+和Zn2+是叶绿素生物合成和光合作用的必需元素[25]，10 μg·L-1MCs 胁迫下水稻中Mg2+、Fe2+和Zn2+含量的增加利于维持地上部光合作用以适应MCs 胁迫。同时N 元素的增加利于提高酶活性调节激素含量，如生长素（IAA）和玉米素（ZT），从而有助于调节水稻的生长[26]。由于植物中Fe、Zn与P存在竞争作用和拮抗作用[27-28]，该处理水稻中Fe2+、Zn2+含量的增加可能造成PO3-4含量的降低。这些营养元素含量的变化是水稻幼苗对10 μg·L-1MCs胁迫的适应性机制之一。100 μg·L-1MCs 组水稻幼苗中K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、PO3-4和NO-3的含量降低，Ca2+、Fe2+和NH4+含量增加，造成营养元素失衡。Freitas 等[29]用100 μg·L-1MC-LR 处理生菜，10 d 后发现叶中矿质元素（Mg、K、P、Mn、Fe、Zn、Cu 和Mo）含量均降低。这表明MCs 处理下植物中营养物质含量的变化并不一致，可能与植物物种、发育阶段、毒素性质和暴露时间等有关。1000 μg·L-1MCs组水稻幼苗中除Ca2+含量增加外，其他元素含量均降低，且降幅大于100 μg·L-1MCs组。Ca作为植物信号传导的第二信使，其含量的增加有助于与钙结合蛋白作用，发挥Ca2+的传感器功能，结合基因启动子中的顺式元件来调节植物对逆境的应激反应[30]。结合本项目组前期的报道[8-9]，高浓度MCs（100 μg·L-1和1000 μg·L-1）处理下矿质营养元素的失衡可能与水稻幼苗体内MCs的高积累有关，是造成水稻幼苗光合作用和生物量积累受抑的又一重要原因。

恢复7 d 后，1 μg·L-1和10 μg·L-1MCs 组水稻幼苗中各矿质营养元素含量均在对照水平。100 μg·L-1MCs 组水稻幼苗中矿质元素含量较胁迫期有所恢复，利于水稻生长的自我修复，这与我们前期的研究相一致[8]。1000 μg·L-1MCs 组水稻幼苗中矿质元素含量较胁迫期恢复程度较小。由此表明，解除MCs 暴露后植物营养物质的恢复受MCs 暴露浓度制约。

2.2 MCs对水稻幼苗根系活力的影响

根系活力反映根系吸收水分和营养元素的能力[31]。如图1 所示，胁迫7 d 后，1 μg·L-1MCs 组水稻幼苗根系活力增加，这与我们前期研究结果相一致[8]。10 μg·L-1MCs 组水稻幼苗根系活力增加，且增幅大于1 μg·L-1MCs 组，推测此处理刺激了根系中物质的合成，增强根系的代谢能力，这可能是水稻幼苗对低浓度MCs 胁迫的一种适应性机制。100 μg·L-1和1000 μg·L-1MCs 组根系活力显著降低，且降低程度随着MCs 浓度的增大而增强。此处理根系活力的降低可能与水稻根细胞功能受到破坏，以及根表形貌和生长受到抑制有关[8]，进而不利于根系吸收水分和营养物质。

表1 MCs对水稻幼苗矿质营养含量的影响Table 1 Effect of MCs on mineral element content of rice seedling

恢复7 d 后，1 μg·L-1和10 μg·L-1MCs 组水稻幼苗根系活力恢复至对照水平，利于水稻营养吸收的正常进行。100 μg·L-1MCs 组水稻幼苗根系活力较胁迫期增加，有利于水稻营养吸收能力的自我恢复。而1000 μg·L-1MCs组根系活力低于对照且低于胁迫期，表明高浓度MCs 暴露对水稻幼苗根系功能造成了不可逆的伤害。

2.3 MCs 对水稻幼苗根系ATP 含量和质膜H+-ATP 酶活性的影响

质膜H+-ATPase 通过水解ATP产生能量，为营养物质跨膜运输提供电化学势梯度[12]。前期研究表明，酸雨胁迫下植物营养元素的含量与质膜H+-ATPase的活性呈正相关关系[17]。如图2 所示，胁迫7 d 后，1 μg·L-1MCs 组水稻根系ATP 含量和质膜H+-ATPase活性无显著变化，与该处理下营养元素无显著变化相一致。结合根系活力的变化，表明1 μg·L-1MCs 处理下水稻中营养元素含量的变化可能主要受质膜H+-ATPase 活性的调控。10 μg·L-1MCs 处理导致质膜H+-ATPase 活性显著上升，加快了ATP 的水解，泵出更多的H+增强电化学势梯度。陈颖等[32]发现，在镉胁迫下龙葵通过调节质膜H+-ATPase 活性改变体内N、P 和K 的含量，从而起到对Cd 胁迫的解毒作用。因此，质膜H+-ATPase 还可以通过调节营养元素（Mg2+、Fe2+、Zn2+和NO-3）的吸收来增强水稻幼苗对MCs 胁迫的耐受性。100 μg·L-1与1000 μg·L-1MCs 处理导致ATP 含量和质膜H+-ATPase 活性显著降低，且降低程度随着MCs 浓度的增大而增强。推测高浓度MCs 抑制了水稻根系中ATP的合成，使质膜H+-ATPase 活性降低，泵运H+的功能受损，不利于为矿质营养元素的跨膜运输提供能量[10]。

图1 MCs对水稻幼苗根系活力的影响Figure 1 Effect of MCs on root activity of rice seedling

恢复7 d 后，10 μg·L-1MCs 组水稻根系质膜H+-ATPase 活性和ATP 含量恢复至对照水平，是矿质营养元素恢复的又一重要原因。100 μg·L-1与1000 μg·L-1MCs 组H+-ATPase 活性和ATP 含量仍显著低于对照，但较胁迫期有所增加，其中1000 μg·L-1MCs 组较胁迫期增加程度较小。解除MCs 暴露后植物营养吸收的恢复程度与MCs 处理浓度、MCs 积累量、不同生育期和不同器官等因素有关[33]。通过对矿质营养元素含量与质膜H+-ATPase活性进行相关性分析（表2）发现，在胁迫期和恢复期质膜H+-ATPase 活性与Ca2+含量呈显著负相关，与其他矿质元素均呈显著正相关。其中K+、Na+、Mg2+、Zn2+、PO3-4、NO-3的吸收受质膜H+-ATP 酶活性影响较大。上述结果表明，MCs 胁迫导致的水稻幼苗中营养元素含量的变化受质膜H+-ATPase活性的调控。

图2 MCs对水稻幼苗根系ATP含量和质膜H+-ATPase活性的影响

2.4 MCs对水稻幼苗根系质膜H+-ATPase基因表达的影响

水稻中质膜H+-ATPase 由多基因家族编码，并且已鉴定出5个不同的亚家族Ⅰ（OSA1、2、3），Ⅱ（OSA5、7），Ⅲ（OSA9），Ⅳ（OSA4、6、10）和Ⅴ（OSA8）[34]。由图3可知，胁迫7 d后，1 μg·L-1MCs组水稻根系质膜H+-ATPase 的编码基因OSA1、OSA3 和OSA8 的相对表达量虽显著上调，但质膜H+-ATPase 活性无变化。这可能由于质膜H+-ATPase 的活性不仅与转录水平有关，还受翻译和磷酸化修饰等过程的调控[35]。在正常条件下，植物中亚家族Ⅰ（OSA1、2、3）和Ⅱ（OSA5、7）通常为高表达，Ⅲ（OSA9），Ⅳ（OSA4、6、10）和Ⅴ（OSA8）通常为低表达[36]。10 μg·L-1MCs 处理OSA1、OSA2、OSA3、OSA4、OSA6、OSA8、OSA9 的相对表达显著上调，这可能是水稻对MCs胁迫的一种适应性机制。结合该处理质膜H+-ATPase 活性变化可知，10 μg·L-1MCs 诱 导 亚 家 族Ⅰ（OSA1、2、3），Ⅲ（OSA9），Ⅳ（OSA4、6）和Ⅴ（OSA8）的表达上调可能是质膜H+-ATPase 活 性 增 加 的 原 因。100 μg·L-1MCs 组 除OSA2、OSA3 和OSA9 外，其他基因的相对表达量均显著下调。结合质膜H+-ATPase 活性降低可知，亚家族Ⅰ（OSA1），Ⅱ（OSA5、7），Ⅳ（OSA4、6、10）和Ⅴ（OSA8）的表达下调可能是质膜H+-ATPase 活性降低的原因。1000 μg·L-1MCs 组各基因的相对表达量均显著下调，且下调幅度大于100 μg·L-1MCs 处理组，与1000μg·L-1MCs 组质膜H+-ATPase 活性低于100 μg·L-1MCs 组的结果相一致。结合之前的报道可知[9]，MCs（100 μg·L-1和1000 μg·L-1）胁迫水稻根系质膜H+-ATP 酶基因表达下调，不利于质膜H+-ATP 酶活性增加，进而阻碍植物对矿质元素的吸收，是高浓度MCs处理下水稻生物量下降的重要原因之一。

表2 水稻幼苗中矿质营养元素含量与质膜H+-ATPase活性的相关性Table 2 Correlations between mineral element content and plasma membrane H+-ATPase activity in rice seedlings

图3 MCs对水稻幼苗根系质膜H-ATPase基因表达的影响Figure 3 Effect of MCs on the expression levels of genes encoding plasma membrane H+-ATPase in rice seedling roots

恢复7 d 后，1 μg·L-1MCs 组水稻根系中OSA1和OSA3 相对表达量仍高于对照而低于胁迫期，OSA10 相对表达量仍低于对照组。10 μg·L-1MCs处理组OSA2、OSA3、OSA4、OSA8 和OSA9 的相对表达量显著低于对照且低于胁迫期，其他基因表达恢复至对照水平，利于调节根系质膜H+-ATPase 活性的 自 我 恢 复。100 μg·L-1MCs 组OSA1、OSA4、OSA5、OSA6 和OSA8 相对表达量较胁迫期增加，与质膜H+-ATPase 活性较胁迫期增加一致。1000 μg·L-1MCs OSA1、OSA4、OSA6 相对表达量较胁迫期增加，而OSA3、OSA5、OSA7 和OSA10 相对表达量低于胁迫期。推测高浓度MCs 损伤了质膜H+-ATPase 的构象和功能[17]，对编码H+-ATPase 的基因转录水平造成了不可逆的抑制，进而不利于质膜H+-ATPase活性的增加。通过对比质膜H+-ATPase 基因表达和质膜H+-ATPase 活性的一致性，发现亚家族Ⅰ（OSA1），Ⅳ（OSA4、6）和Ⅴ（OSA8）能较好地响应MCs 胁迫，对调控质膜H+-ATPase 活性的变化具有重要作用。

3 结论

（1）低浓度MCs（1 μg·L-1）对水稻幼苗质膜H+-ATPase 和矿质营养含量无影响。10 μg·L-1MCs 处理组质膜H+-ATPase 基因表达的上调有益于质膜H+-ATPase 活性上升，促进水稻对矿质营养的吸收，增强了水稻幼苗对MCs 胁迫的适应性，经7 d 后恢复至对照水平。

（2）高浓度MCs（100 μg·L-1和1000 μg·L-1）处理组通过下调质膜H+-ATPase 基因表达量来降低质膜H+-ATPase 活性，阻碍了水稻对矿质元素的吸收。恢复7 d 后100 μg·L-1MCs 组各项指标优于胁迫期，而1000 μg·L-1MCs 对水稻根系营养吸收造成不可逆伤害。表明恢复效果与MCs浓度有关。

（3）MCs 胁迫下质膜H+-ATPase 活性变化调节了根系对营养元素的吸收，进而增强了植物对MCs胁迫的适应性。