动脉粥样硬化中circRNA-miRNA-mRNA的内源竞争RNA机制*

黄 鹏， 徐 瑞， 娄小倩， 谭 琦， 任立群

(吉林大学药学院， 吉林 长春 130000)

[中图分类号]R363.2; R543.5[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2019.11.026

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一个复杂的病理过程，涉及脂质积累、内皮受损、单核/巨噬细胞吞噬、泡沫样细胞形成、平滑肌细胞迁移、胶原纤维堆积、炎症反应等复杂机制[1-3]。研究表明，超过一半的心血管疾病(包括AS等)均与遗传有着密不可分的联系[4-5]。近年来随着人们对基因组认识的完善，越来越多的学者将目光转向了非编码RNA，其中，微小RNA(microRNA，miRNA，miR)的研究最为火热，miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。目前已发现成百上千的miRNA与AS有关，例如Gao等[6]发现miR-126和miR-143可作为脑动脉硬化的生物标志物，Li等[7]发现循环miR-664a-3p作为动脉粥样硬化的非侵袭性标志物。随着研究的深入，学者们发现诸如长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和环状RNA(circular RNA，circRNA)等其它非编码RNA对miRNA具有调控作用[8-14]。circRNA与miRNA和lncRNA均属于非编码RNA，但结构不同，circRNA的3’和5’端共价连接从而形成闭合环状结构，因此，circRNA拥有更强的核酸内切酶耐受性，在细胞内更稳定。这一特性引起了学者广泛的兴趣。circRNA的形成途径多种多样，目前学者们已在circBase鉴定并注释了数以千计的circRNA[15]。根据circRNA的不同来源可以将其分为外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和基因间circRNA共4类[16]。研究表明，在染色体片段Chr9p21上存在着大量能够影响AS的circRNA[17]，这些circRNA在AS中扮演着举足轻重的角色，对于脂质积累、内皮损伤、细胞吞噬、纤维化和炎症因子表达都有重要作用。通过研究发现，circRNA可以通过调节rRNA前体的成熟来控制核糖体生成和核仁应激，调控细胞增殖与分化[18]。同时circRNA具备miRNA或蛋白质的功能，如对转录的调节和对剪接的干扰，甚至翻译以产生多肽的功能，进而改变细胞表型。然而最能引起学者广泛关注的还是circRNA作为分子海绵吸附特定的miRNA，从而减少游离的miRNA，解除miRNA对于转录的干扰从而调节基因的表达[19]。因此本综述主要讨论AS中circRNA通过充当miRNA分子海绵进而调控mRNA这一机制，即circRNA-miRNA-mRNA的内源竞争RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)机制,进而探寻AS诊断与治疗的新靶点和新思路。

1 动脉粥样硬化的分子病理过程

动脉壁可分为内膜、中膜和外膜。内膜主要由内皮细胞构成，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)构成中膜，肥大细胞、纤维母细胞等构成外膜[20]。“正常”水平的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)到达动脉壁后, 受到邻近单核-巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌的影响作用被氧化形成氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)。在诸如遗传、高血压、糖尿病等某种病理因素的影响下，脂质代谢紊乱，ox-LDL和胆固醇等脂质物大量堆积，诱发单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和单核细胞黏附分子在管腔表面生成，从而造成内皮细胞的损伤[3]。内皮细胞受损后通透性显著增加，单核巨噬细胞因而进入中膜，并开始吞噬一同由内膜浸润的ox-LDL，慢慢地单核巨噬细胞演变形成泡沫细胞[21]。随着AS的发生发展，泡沫细胞大量聚集坏死。同时，大部分学者认为AS是一个以血管壁炎症改变为主的慢性进行性疾病[22]。内皮细胞受损的同时会促进肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-8等炎症因子及细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞间黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、E-选择素(E-selectin)等黏附分子的产生[23]。由于中膜环境发生改变，在血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)的引导下，VSMCs逐步向内膜迁移，并逐渐聚集在坏死的泡沫样细胞和凋亡的VSMCs周围, 与由胶原纤维和弹力纤维组成纤维帽一起逐步形成坏死核心[24]。

2 circRNA与AS

2.1circRNA与脂质浸润 脂质代谢紊乱表现出的高脂血症是AS发生发展的物质基础。ox-LDL和胆固醇损伤内皮细胞是AS形成的早期阶段。据报道，中国淮南猪(瘦型)和西方洛克猪(脂肪型)有66个差异表达的circRNA，这表明circRNA在脂质代谢过程中有重要作用[25]。Li等[26]利用莱芜猪皮下组织构建基因芯片，并通过分析建立了影响脂质代谢的circRNA-miRNA-mRNA表达网络，推测circRNA_26852能够发挥ssc-miR-486分子海绵的作用，通过抑制ssc-miR-486进而上调靶基因ABHD5，激活甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)促进脂肪分解；SCD基因是ssc-miR-27b-3p的靶基因，是脂肪生成中的关键酶，circRNA_11897通过发挥miR-27b-3p分子海绵作用而调控脂质代谢。因而，我们可以推断circRNA_26852和circRNA_11897可作为AS治疗与诊断的新靶点。

2.2circRNA与内皮细胞损伤 脂质浸润后造成的内皮损伤是形成AS的关键步骤。Li等[27]在ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中进行circRNA微阵列分析，发现943个差异表达的circRNA，并发现沉默circRNA_ 003575可改善HUVECs的血管生成能力，并推测存在circ_0003575—miR-199-3p/miR-9-5p/miR-377-3p/miR-141-3p—mRNA的ceRNA机制。Shen等[28]发现circRNA_0044073在动脉粥样硬化中上调，并通过抑制miR-107激活JAK/STAT信号传导途径，从而促进HUVECs的增殖和侵袭，这为AS的治疗提供了新策略和新靶标。

2.3circRNA与血管平滑肌细胞增殖和迁移 内皮细胞损伤，单核细胞吞噬ox-LDL逐步形成泡沫样细胞，血管平滑肌细胞增殖和迁移促成了斑块形成，是AS发生发展的主要步骤。VSMCs的变化与AS的形成相关，而circRNA对于调控VSMCs的生长分化有着关键作用。Xu等[29]建立了球囊损伤颈动脉模型，发现circDiaph3通过上调Igf1r的表达从而促进VSMCs的增殖和迁移。同时有研究表明，circ-SATB2通过抑制miR-939上调STIM1的表达，从而促进血管平滑肌细胞增殖和迁移[30]。沉默circ-SATB2，或者阻断circ-SATB2与miR-939的结合可能成为治疗AS的新方法，同时circ-SATB2可能成为AS诊断的生物标志物。Zou等[31]发现在人的胸主动脉夹层疾病(thoracic aortic dissection，TAD)中上调的circRNA_101238可通过充当miRNA分子海绵而抑制hsa-miR-320a的表达，进而增加几种TAD相关mRNA，尤其是基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein，MMP9)的表达。MMP9属于基质金属蛋白酶家族，它会导致血管平滑肌细胞向内膜侵入和迁移, 并分泌细胞外基质, 从而促进斑块的形成[32]。因此，circRNA_101238是AS的潜在诊断因子，下调circRNA_101238可成为AS治疗的新思路。

2.4circRNA与血小板 AS的斑块形成过程中，血小板也参与其中。据报道，circRNA在血小板中大量存在，并有选择地被囊泡包裹、释放到细胞外，这种现象在外泌体中尤为明显[33]。这些囊泡富含circRNA等大量遗传物质和生物活性蛋白，可特异性被诸如内皮细胞等受体细胞识别，我们称之为血小板膜结合微粒(platelet membrane binding microparticle，MP)。MP与内皮细胞结合后，调控内皮细胞表型的改变，在AS的发生发展中起着重要作用。Zhang等[34]在兔中构建了circRNA-miRNA-mRNA网络的AS发病机制:在细胞黏附因子网络中，112个circRNA和60个mRNA竞争70个miRNA；预测出了7个circRNA(ocu-cirR-novel-18038、ocu-cirR-novel-18298、ocu-cirR-novel-15993、ocu-cirR-novel-17934、ocu-cirR-novel-17879、ocu-cirR-novel-18036和ocu-cirR-novel-14389)通过circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA机制参与血小板对内皮细胞的信号传导和血小板相关黏附因子的表达，进而影响AS的发生。这7种circRNA极有可能成为AS的诊断因子和新的潜在治疗靶点。

2.5CircRNA与免疫炎症反应 AS可以看作是脂质代谢紊乱引起的一种慢性、进行性免疫炎症反应。Zhang等[35]发现circARF3可作为内源miR-103的分子海绵在体外和体内抑制由脂质代谢紊乱引起的炎症反应。circ-ARF3解除了miR-103对肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族和IL-1受体/Toll样受体(IL-1R/TLR)超家族的重要信号转导分子——肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3)的抑制，TRAF3表达增加，增强对核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路的抑制，增强线粒体自噬，减弱炎症反应。因而，circARF3可能成为治疗AS的新靶点和新思路。除了脂质代谢紊乱引发炎症外，内皮细胞和VSMCs在AS的发生发展过程中的改变均会诱导炎症因子的释放，激发免疫反应，因而上述介绍的相关circRNA均可诱导免疫炎症反应。

AS中circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA部分机制归纳总结见表1。

表1 AS中circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA部分机制

Table 1.Partial ceRNA mechanism of circRNA-miRNA-mRNA in AS

circRNAmiRNAmRNAcircRNA_26852ssc-miRNA-486ABHD5circRNA_11897miR-27b-3pSCDcirc_0003575miR-199-3pAngiogenesis-related genesmiR-9-5pmiR-377-3pmiR-141-3pcircRNA_0044073miR-107JAK/STATcirc-SATB2miR-939STIM1circRNA_101238hsa-miR-320aMMP9circ-ARF3miR-103TRAF3

3 小结

越来越多的研究表明，circRNA确实在AS的发生发展中有重要作用，广泛参与AS发生发展中包括脂质浸润，内皮细胞损伤，VSMCs增殖迁移，泡沫细胞形成，炎症免疫反应等各个过程。鉴于其环状结构形成的高稳定性，circRNA将会成为AS新型的生物标志物和干扰候选物。而大部分circRNA通过与miRNA的结合发挥分子海绵的作用，寻找AS中差异miRNA和circRNA，构建AS中的circRNA-miRNA-mRNA纵向网络极为重要。但是circRNA、miRNA与mRNA的作用并不是单向的，mRNA的表达同样可以影响circRNA。据报道，当外显子侧翼的内含子长度比较长时，发生典型线性剪切的效率会显著下降，而发生环化的效率显著提高，这说明转录时circRNA可以与mRNA前体发生剪切竞争[36-39]。这也为我们干预circRNA的表达提供了新思路，为circRNA-miRNA-mRNA纵向网络的构建提供了依据。总之，对于今后AS的研究与治疗，无论是作为诊断过程的生物标志物还是治疗靶点，circRNA都具有极为重要的研究价值。