金钗石斛茎段诱导丛生芽的探究

邓坦 甘婕

摘要：以金钗石斛一年生茎段组织为外植体，采用不同种类的培养基与不同配比的添加物进行了培养实验。结果表明：以MS培养基-+-6-BA0.5mg/L+NAA 0.3rag/L+1g/L活性炭，加入10%的马铃薯作为天然添加物，pH值为5.8时，是金钗石斛丛生芽增殖的最佳培养基。

关键词：金钗石斛;茎段;丛生芽诱导

中图分类号：$641.1文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）15-0102-04

1引言

金钗石斛（Dendrobium nobile LindI），属于兰科植物，多年生草本，其茎含有生物碱，主要为石斛碱（den-drobine）、6-羟基石斛碱（6-hydroxydendrobine）、石斛次碱（nobilonine）、多糖和多种游离氨基酸等。金钗石斛总生物碱的含量多达0.755%，多糖含量高达22.5%，属于上品药用石斛。研究显示：金钗石斛含药用成分有15种之多，性不热、不温、不凉，养胃、清热解毒、止咳清肺、软化血管等多重功效，需求量大，前景好。金钗石斛的花奇特并且鲜艳，因此具有观赏价值。金钗石斛能进行光合作用的有效面积小，光合效率较低，生长发育速率低，对气候条件要求非常苛刻，在自然的条件下金钗石斛需要与某些真菌互利共生才能生長，因此对于苗的栽培往往很难实现，而过去采用的分株、扦插等方式的繁殖率较低，金钗石斛的供需不平衡，当下我国将其列为中药植物重点保护对象。目前国内主要采用快繁的方式来克服并解决各类石斛的供需问题，因此，金钗石斛的组织培养至关重要，这是实现金钗石斛大规模繁殖的途径之一。本研究有助于探索如何快速培养金钗石斛，因此采用金钗石斛的茎段组织进行丛生芽诱导，确保金钗石斛的供应。

2材料与方法

2.1实验材料

本次实验材料来源于赤水金钗石斛栽培基地，通过移栽培育苗到实验室种植，以供实验使用。

2.2实验设计

2.2.1第一组设计

不同植物提取液的培养基对金钗石斛茎段组织芽诱导的影响。

选取金钗石斛茎幼嫩的茎段部分，将外植体放人不同植物提取液的培养基中培养，观察生长状况，从中选出茎段组织芽诱导的最适培养基。

2.2.2第二组设计

不同植物提取液的培养基在加入活性炭后对金钗石斛茎段组织芽诱导的影响。

选取金钗石斛茎的幼嫩的茎段部分，将外植体放入不同的植物提取液在加入活性炭的培养基中培养，观察其生长状况，并对比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的萌芽率情况，从而选出最适合金钗石斛茎段组织芽诱导的培养基。

2.2.3第三组设计

相同的植物提取液对比活性炭的有无对金钗石斛茎段组织芽诱导的影响。

选取金钗石斛茎的幼嫩的茎段部分，将外植体放入相同的植物提取液的培养基中培养，但是其中一组加入活性炭，对比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的生长情况，从而选出最适合金钗石斛茎段组织芽诱导的培养基。

2.2.4分组实验

将此次实验分为三大组（表1）。

3实验过程

3.1接种前接种室的准备

首先接种室要时刻保持干净，接种前要对接种室进行清洁，清扫干净每个角落，并用酒精擦拭地板，将酒精灯、滤纸、酒精棉球、75%酒精、无菌水、镊子、手术刀等实验试剂及实验工具器械放入超净工作台。打开超净工作台里的紫外灯和接种室内的紫外灯进行消毒灭菌，照射2h。照射时间到后将紫外灯关闭，并打开超净工作台，风机适度风力吹5～6min后，即可进行实验。

3.2外植体处理和接种

选出没有病害且长势好的当年生长的幼茎，将节上的叶片去掉，再置于烧杯中，用流动的自来水冲洗10min，冲洗后再放入洗洁精溶液中清洗2min，再用自来水冲洗一次，再用无菌水将其漂洗3次（使外植体的大量菌流走），最后置于干净的烧杯接种备用。在进行实验操作前，将双手用酒精仔细消毒，以防止一开始就将细菌带入超净工作台。在超净工作台上，首先将工作台擦拭干净，将酒精灯点燃，将滤纸摆放好，将准备好的金钗石斛的茎段组织放在滤纸上，用实验工具将其切成大小适中的小节，长约为5cm，方便进行消毒灭菌，将切好的茎段组织放进锥形瓶中，倒入75%的酒精摇荡处理30s，处理时间到后立即倒出酒精并及时倒入无菌水，然后反复清理润洗2～3次，再加入准备好的0.1%升汞处理材料8min。实验操作过程中，要来回、反复的摇动锥形瓶，保证材料能够充分灭菌，处理时间到后将升汞倒人回收瓶，并用无菌水清洗2～3次。最后将材料取出放在滤纸上并切成带节的小段，每段约长为1.5cm，之后接入培养基中，一瓶培养基接种一小段或两段。为避免相互污染，接种完后对其进行编号，然后放入培养室对其进行观察、记录生长数据。接种过程中所用实验工具都要进行高温灭菌，尽量避免交叉接触，在实验中，操作要轻、慢，以减少污染率。

3.3培养条件

适宜的培养条件对金钗石斛的组织培养非常重要，因此我们选择将接种好的外植体置于光照培养室中培养，培养温度25～28℃，每天用日光灯照射12h，光照强度为2000Lx，并定期观察茎段组织的生长情况。

4结果与分析

4.1不同植物提取液对金钗石斛茎段组织芽诱导的结果

5讨论

本次实验采用不同添加物的培养基对金钗石斛茎段组织进行丛生芽诱导，以不同的培养基对金钗石斛丛生芽的情况来选出最适合繁殖金钗石斛的方法。通过3种不同添加物对金钗石斛茎段组织的丛生芽诱导发现，经过60d的培养，可以明显观察到区别。通过表2我们可以得知，马铃薯有利于诱导芽的增殖，其中以MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L-t-10%马铃薯培养基最佳;在第一组实验的基础上，加入了活性炭进行对比，由此，通过表3可以得知MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%马铃薯在加人1g/L活性炭时为最佳;最后，单独将5种不同的培养基进一步的进行对比，可以发现MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%马铃薯+1g/-活性炭培养基的诱导芽数最高。

适宜的培养条件及培养基对金钗石斛的茎段组织丛生芽的培养和快速繁殖十分重要，通过实验数据我们可以清楚地发现在添加活性炭后茎段组织从生芽的数量显著增加，这是由于活性炭吸附了茎段组织丛生芽增殖中代谢过程中的废弃物，促进金钗石斛的形态发生和器官形成。马铃薯能促进茎段组织丛生芽的分化，在添加马铃薯的培养基中再加入活性炭，此时对于金钗石斛茎段组织丛生芽的生长效果更为显著。金钗石斛的茎段组织在添加香蕉汁后对于丛生芽的增殖有明显的压制影响作用，造成这种现象很可能是因为香蕉中含有对茎段组织丛生芽诱导生长的抑制性物质，但香蕉汁能使根系生长的粗壮，对于茎段组织的丛生芽增值、分化没有明显的作用。

在丛生芽诱导的过程中，消毒、灭菌是一项十分重要的工作，关系到整个实验的成败。本次实验的污染率比较高，其中一些污染菌类是分散在培养基中，也有一些是从材料周围长起。污染的原因很可能是由于接种使用的实验工具器械的灭菌不彻底、接种时瓶的开口时间太长、接种室内物品摆放杂乱、接种室紫外灯的灭菌时间太短、接种材料没有进行彻底的灭菌、材料自带的共生菌等原因。