加味补阳还五汤在大鼠视神经损伤修复中的作用研究△

李宏松 龙潭 吴惠琴 杜蕊 陆慧琴 赵隽

外伤性视神经损伤是一种严重危害视功能的眼外伤疾病，常与颅脑外伤并发，占头部闭合性损伤的0.5%～5.0%[1]。目前，该病的具体发病机制尚未完全明确，因此仍缺乏较好的治疗方法，预后不佳。近年研究表明，补阳还五汤具有益气活血、通经活络、益精明目之功效，在外周神经损伤的动物实验及临床应用中取得较好的疗效[2-4]。本实验拟建立外伤性视神经损伤的大鼠模型，探讨加味补阳还五汤在视神经损伤修复中的作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选取健康SD雄性大鼠30只，6～8周龄，体质量200～250 g。眼科常规检查未见明显疾病。由西安交通大学医学院实验动物中心提供并进行常规饲养。实验动物及实验条件的配置符合《实验动物管理条例》。本研究方案通过西安市第一医院伦理委员会的审查并批准实施。

1.1.2 主要试剂和仪器加味补阳还五汤组方：生黄芪3 g、当归 3 g、赤芍 2 g、地龙3 g、川芎 2 g、红花2 g、桃仁 0.5 g、丹参3 g(西安市第一医院制剂室制备；生药浓度约为 1 g·mL-1溶液，无菌罐封后置入 4 ℃冰箱中保存备用)。TUNEL染色试剂盒(美国PROMEGA公司)；SP系列试剂盒(美国ZYMED公司)；手术显微镜(日本拓普康)；眼科显微手术器械(中国苏州医疗器械厂)；眼科电生理检测仪(德国罗兰公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组随机将大鼠分为药物组、生理盐水组及空白对照组，每组10只，药物组及生理盐水组制作动物模型，并于造模后每日固定时间灌胃加味补阳还五汤和生理盐水，每天2次，药物组每日总剂量10 g·kg-1[5]；空白对照组不做处理。

1.2.2 动物模型制作均以右眼为实验眼。参照文献建立单眼视神经损伤模型[6-7]，具体步骤：大鼠以100 g·L-1水合氯醛注射液(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后侧卧于显微镜下，从外眦部球结膜与穹隆结膜交界处剪开结膜及巩膜约1/4 象限，钝性分离筋膜组织至暴露视神经，轻轻剥开视神经表面鞘膜，在球后约2 mm的位置使用50 g力的反向夹持镊垂直于视神经长轴夹持视神经10 s，其后眼表涂红霉素眼膏。次日观察术眼，瞳孔散大，直接对光反射消失，间接对光反射存在，直接检眼镜下观察视网膜血供良好，眼球无明显突出者为造模成功。

1.2.3 闪光视觉诱发电位于造模前及造模后 1 d、1周、2周、4周、6周检测各组大鼠右眼闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,F-VEP)，具体步骤：以100 g·L-1水合氯醛注射液(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后，复方托品酰氨散瞳。采用银针电极，阻抗<2 kΩ，暗适应后在暗室内用全视野闪光刺激器检查双眼，频率2 Hz，通频带宽1～100 Hz，分析时间 250 ms，叠加 100 次，连续测量至少 3次。检查右眼时，左眼用不透光黑眼罩完全遮盖。记录P波的潜伏期和振幅。

1.2.4 HE染色分别于造模后1 d、1周、2周、4周、6周每组各处死2只大鼠，分离暴露并剪断视神经，立即将眼球放入新鲜配制的40 g·L-1多聚甲醛固定液中固定48 h，取出修整后，置于体积分数 95%酒精过夜，然后置于体积分数100%Ⅰ、体积分数100%Ⅱ梯度酒精及二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1 h脱水，62 ℃烤箱浸蜡Ⅰ、蜡Ⅱ、蜡Ⅲ各1 h，石蜡包埋、切片。各组每个时间点随机取3张切片行常规HE染色，显微镜下观察各组大鼠视网膜形态变化。

1.2.5 免疫组织化学染色Caspase-3免疫组织化学染色严格按照SP试剂盒说明进行。各组每个时间点随机取1.2.4内切片3张，采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，每张切片随机检测3个区域平均光密度值，进行半定量分析。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0行统计学分析。计量数据均以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点F-VEP变化F-VEP结果显示，造模前3组大鼠P波潜伏期间差异均无统计学意义(均为P>0.05)；造模后，生理盐水组、药物组与空白对照组相比P波潜伏期均有延长。造模后1 d、1周、2周，生理盐水组与药物组P波潜伏期相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)；造模后4周、6周，与生理盐水组相比，药物组P波潜伏期明显缩短，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

造模前3组大鼠P波振幅相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后，与空白对照组相比，生理盐水组、药物组P波振幅均有先升高后降低的趋势。药物组、生理盐水组在造模后1 d、1周与空白对照组相比，P波振幅均略有升高，但差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后2周、4周、6周，药物组和生理盐水组P波振幅均下降，特别是造模后4周、6周生理盐水组P波振幅下降更明显，而药物组趋于平稳，两组相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠不同时间点F-VEP的P波潜伏期

2.2 各组大鼠视网膜形态学观察HE染色结果显示，空白对照组大鼠视网膜层次清晰，细胞排列整齐，视网膜神经节细胞层单层排列，无明显坏死细胞；生理盐水组和药物组造模后1 d可见视网膜明显水肿、厚度增加，部分视网膜神经节细胞出现空泡样改变；生理盐水组随时间推移，视网膜厚度变薄，组织萎缩，视网膜神经节细胞发生空泡样改变的比例增加；药物组造模后1周视网膜水肿减轻，造模后2周、4周、6周空泡样改变的视网膜神经节细胞数量减少，细胞形态逐渐接近空白对照组(图1)。

表2 各组大鼠不同时间点F-VEP的P波振幅

图1 各组视网膜HE染色结果(×200)。A：空白对照组；B：药物组；C：生理盐水组(1-5分别代表造模后1 d、1周、2周、4周及6周)

2.3 各组大鼠视网膜中Caspase-3蛋白表达结果Caspase-3阳性表达细胞为细胞质内棕黄色或褐色染色。免疫组织化学染色结果显示，空白对照组未见Caspase-3蛋白明显表达，生理盐水组及药物组在造模后1 d Caspase-3蛋白开始表达。造模后1周达到峰值，而后逐渐减少。造模后2周、4周、6周，生理盐水组Caspase-3蛋白表达均明显高于药物组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；随时间推移，药物组Caspase-3蛋白表达逐渐减少，造模后4周时 Caspase-3蛋白表达量接近空白对照组。见表3。

表3 各组大鼠造模后不同时间点Caspase-3蛋白的表达

3 讨论

外伤性视神经病变在中医中属“撞击暴盲”或“青盲”范畴。《证治准绳》称之为“触伤真气证”，认为本证为“打动珠中真气、络涩滞而郁遏，精华不得上运，损及瞳神而为内障之急”。根据中医气虚理论，我们认为外伤后眼中真气受损，气虚不能推动血脉运行，致使目系脉络淤滞；或外伤损及目系，脉络受损，血溢络外，导致血淤，两者均导致目系失养，后期发生视神经萎缩。本病的病理机制为：气虚血淤，为本虚标实之证，确定补气活血为治疗本病之大法。

目前，大量研究表明，中药在外伤性视神经病变中起到积极的治疗作用。孔祥梅等[8]观察甲钴胺治疗钳夹伤的SD大鼠发现，视神经轴突和视网膜神经节细胞异形改变明显减少，有效延缓了视神经的进一步损伤。肖家翔等[9]采用养血行血方治疗钳夹伤的大鼠，结果表明，造模后大鼠视网膜神经纤维层厚度增加，视网膜神经节细胞肿胀，呈空泡样变性，而养血行血方改善了视网膜的病理改变。

本研究建立钳夹视神经挫伤的大鼠模型，采用加味补阳还五汤进行灌胃处理，观察视神经损伤程度及修复机制。加味补阳还五汤以补阳还五汤为主，加丹参药物组成。补阳还五汤始载于《医林改错》，具有补气活血，通经活络的作用。补阳还五汤中重用黄芪为君药，取其补气以行血通络之意。丹参具有活血通络、去淤止痛之功效。加味补阳还五汤具有益气活血、通经活络、益精明目之功效。根据中医气血理论，气为血行之动力，气行则血行，气滞则血淤；该方立法为补气活血，尤其强调补气的重要作用。

F-VEP检测主要反映视网膜神经节细胞至视觉中枢的传递功能，其在鉴别伪盲、视神经挫伤中具有重要的作用[10]。本研究F-VEP结果显示，造模后 1 d，生理盐水组和药物组P波潜伏期均明显延长，考虑与视神经钳夹所致直接的机械压迫效应造成轴突的急剧损伤有关。造模后1周生理盐水组P波潜伏期变化平稳，而药物组在造模后4周、6周时P波潜伏期明显缩短，但与空白对照组相比仍有一定差距，考虑在药物辅助下部分视神经功能得到恢复，但仍有部分视神经的受损是不可逆的。

HE染色结果显示，视神经损伤后视网膜水肿，与机械性冲击、压迫等原因造成视神经挫伤引起的病理改变有关。造模后4周，药物组视网膜神经节细胞部分恢复，组织结构清晰，尚可见部分细胞呈空泡样改变；而生理盐水组可见大量神经节细胞空泡样改变，且视网膜厚度变薄，组织萎缩。

细胞凋亡在视神经损伤修复过程中具有重要的作用。Caspase-3是凋亡过程中的关键蛋白酶，常以无活性的酶原形式存在，只有在凋亡信号出现时才发生裂解而活化[11]。刘晓坤等[12]研究发现，正常大鼠视网膜几乎无Caspase-3表达，视神经钳夹伤后可见视网膜组织中出现大量Caspase-3阳性染色细胞，主要位于视网膜神经节细胞层、内核层及外核层，损伤后7 d达到峰值，随后表达下降。本研究结果与之一致。本研究还发现，视神经损伤后2周、4周、6周生理盐水组Caspase-3蛋白表达均明显高于药物组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。考虑原因为，早期视神经损伤主要是钳夹视神经造成部分神经纤维轴浆运输阻断，部分视网膜神经节细胞失去营养供给，发生不可逆转的死亡，而另一部分视网膜神经节细胞因为组织水肿、炎症等微环境的改变，诱导细胞凋亡机制的发生，造成视神经的继发性损害。

综上所述，本研究结果表明，加味补阳还五汤在视神经挫伤的修复过程中能改善视神经的损伤，促进神经修复，并且通过抑制细胞凋亡分子的表达，为神经损伤修复提供良好的微环境。本实验为加味补阳还五汤在外伤性视神经损伤中的应用提供了实验依据，为临床治疗外伤性视神经损伤提供了新的思路。