二氧化钛纳米颗粒的肝细胞毒性及分子机制研究

洪鸿翔，陈劲宇，邓宏健，孙郁雨，袁 锟，王祥宇，崔志明

目前，老龄化已成为世界范围公认的社会问题，衰老导致人体骨量下降、骨质疏松、关节炎症、关节退变，并由此引起重要关节部位疾病、甚至功能的丧失。骨骼问题引起的疾病是最普遍存在的人类健康问题，而生物医用金属材料成为解决这些问题的重要方法之一。二氧化钛（TiO2）是一种具有耐化学腐蚀性、光化学催化特性的无机化工材料，被广泛用于医药、日化、化妆品、食品中。研究表明[1]TiO2能够通过呼吸、消化等途径进入体内，并且在特定部位富集，从而对机体产生毒性。文献报道[2]，TiO2在肝中沉淀最多，随着TiO2浓度的升高，肝功能受到明显损害，并导致抗氧化系统、免疫系统衰竭、全身出现炎症反应等一系列综合征。PD-1/PD-L1信号通路是动物体中较为保守的信号通路，对机体免疫调控起着重要的作用[3]。本研究从PD-1/PD-L1信号通路入手，探讨TiO2对小鼠肝细胞的毒性作用，从而为了解TiO2毒性及其防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂与设备 清洁级ICR小鼠由南通大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK(苏)20020022；TiO2购自上海医药集团；兔抗小鼠 PD-1、 兔抗小鼠 PD-L1、Rat anti-mouse-CD19-FITC、Rat anti-mouse-CD4-FITC、Rat anti-mouse-CD8-PE、兔抗GAPDH及山羊抗兔IgG购自美国abcam公司；IL-6、IL-10、TNF-α、CRP 试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；生化自动分析仪（日本日立，型号：7170），高速冷冻离心机（德国eppendorf,型号：5180），电泳槽（北京六一仪器厂，型号：DYY-Ⅲ），凝胶成像系统（美国 Bio-Rad，型号：GEL DOC2000）。

1.2 模型构建和分组处理 实验前小鼠适应性饲喂5 d，然后随机分为4组，每组30只，分别为空白组、TiO2（低、中、高剂量）组，TiO2组每天分别尾部静脉注射10、50、150 mg/kg的TiO2， 空白组注射10 ml/kg生理盐水，连续注射2 w。

1.3 检测指标

1.3.1 体重及肝脏系数 注射给药2 w后，称量实验小鼠体重后，麻醉、处死，取肝脏，吸水纸吸干水分，准确称量肝脏重量，肝脏系数=肝脏湿重（mg）/体重（g）。

1.3.2 肝功能 上述小鼠处死后，采用摘眼球取血法采集血液，25000 r/min离心10 min分离血清，采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、亮氨酸氨酸肽酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）水平。

1.3.3 血清炎症因子含量 采用上述血清标本，检测白细胞介素 -6（IL-6）、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF-α）、C-反应蛋白（CRP）水平。

1.3.4 肝组织抗氧化酶活性 小鼠处死后，取新鲜肝组织研磨，加入1%聚乙稀吡咯烷酮，5000 r/min离心30 min，取上清液，测定超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，抗坏血酸过氧化物酶(APx)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性。

1.3.5 检测PD-1、PD-L1蛋白表达水平 称取200 mg肝组织，加入裂解液，超声裂解30 s，12000 r/min、4℃离心10 min，收集上清，BCA检测蛋白浓度；待测样品与Loading buffer混合，加入至制备好的SDS-PAGE 凝胶上样孔中，25 μl/孔，4 ℃转膜 1.5 h，采用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，分别加入一抗兔抗小鼠PD-1或兔抗小鼠PD-L1，4℃过夜；TBST洗膜后，加入辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h，ECL显影，以GAPDH作为内参，采用蛋白免疫印迹法检测PD-1和PD-L1蛋白水平。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件分析，计量数据以±s表示，组间比较采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TiO2对小鼠肝脏系数的影响 空白组、低剂量TiO2组、中剂量TiO2组和高剂量TiO2组的肝脏系数分别为（39.87±4.32）、（51.12±4.78）、（63.81±5.04）和（72.95±5.29）mg/kg，各 TiO2组肝系数均显著高于空白组（P＜0.05），且随着剂量增加，肝脏系数逐渐增大（P＜ 0.05）。

2.2 TiO2对小鼠肝功能的影响 各TiO2组血清ALT、AST、ALP、LDH 水平均明显高于空白组（P＜0.05）， 且剂量越大，ALT、AST、ALP、LDH 水平越高（P＜ 0.05，表 1）。

2.3 TiO2对肝组织抗氧化酶活性的影响 各TiO2组肝组织抗氧化酶活性均明显低于空白组（P＜0.05），且剂量越大，肝组织抗氧化酶活性越低（P＜0.05，表 2）。

2.4 TiO2对小鼠血清炎症因子含量的影响 各TiO2组血清炎症因子含量均明显高于空白组（P＜0.05），且剂量越大，炎症因子含量越高（P＜0.05，表3）。

2.5 TiO2对小鼠肝组织PD-1、PD-L1蛋白表达的影响 与空白组比较，各TiO2组肝组织PD-1、PD-L1蛋白表达水平明显升高，且呈剂量效应依赖关系（P＜0.05，图 1）。

3 讨论

随着TiO2的广泛应用，其安全性越来越受重视。TiO2可以通过口腔、鼻腔、皮肤等途径进入机体，通过血液循环、淋巴转运在机体的各器官中沉积，如肝肾等，并对器官产生毒性作用。研究表明[4]，静脉注射TiO21 w后，肝脏明显肿大，肝组织细胞损伤变性，AST和ALT活性上升。本研究采用TiO2构建小鼠肝损伤模型，结果也显示，TiO2能够明显提高肝脏系数，ALT、AST、ALP、LDH 活性明显升高，且剂量越大，ALT、AST、ALP、LDH 水平越高。

表1 各实验小鼠肝功能比较（n=30）

正常情况下，机体内ROS产生和清除处于动态平衡，而TiO2会打破平衡，造成ROS大量积累，进而导致过氧化损伤[5]。研究表明[6]，TiO2在肝细胞中的积累导致ROS和Cyp1a1的表达水平增加，并抑制CAT等多种过氧化物酶的活性，进而导致肝脏的氧化损伤。本研究结果发现，各TiO2组肝组织抗氧化酶活性均明显低于空白组（P＜0.05），且剂量越大，肝组织抗氧化酶活性越低，提示TiO2能够使肝脏抗氧化系统遭受破坏，其毒性效果与剂量呈正相关。

表2 各组肝组织抗氧化酶活性比较（n=30）

表3 各组血清炎症因子含量比较（n=30）

图1 各组PD-1、PD-L1肝组织PD-1、PD-L1蛋白表达水平比较

文献报道[7]，肝内炎症反应会导致肝功能障碍，同时还会加重肝脏重构。既往研究结果显示[8-9]，TiO2能显著激活 MIF、TNF-a、IL-6、IL-1β、CRP、IL-4 和 IL-10等细胞炎症因子 mRNA和蛋白表达水平。本研究结果也显示，TiO2会引起 TNF-α、IL-6、IL-10、CRP水平升高，且剂量越大，炎症因子含量越高，证实TiO2会引起小鼠机体炎症反应。

文献报道[10]，PD-1/PD-L1信号通路在T细胞活化、增殖、免疫细胞和炎症因子产生的过程中起重要的作用，该信号通路激活会抑制免疫系统功能，促进免疫耐受。经典的PD-1/PD-L1信号通路活化表现为PD-1在细胞质中增多，进而调节Th1细胞Th2的反应。本研究结果显示，与空白组比较，各TiO2组肝组织PD-1、PD-L1蛋白表达水平明显升高，且呈剂量效应依赖关系，提示TiO2对肝细胞的毒性作用可能是通过调节PD-1/PD-L1信号通路实现。

综上所述，TiO2可能通过PD-1/PD-L通路对小鼠肝细胞产生毒性作用，且其毒性具有剂量效应关系。