牛至精油对绵羊瘤胃体外养分降解率、发酵特性及CH4产量的影响

周瑞，刘立山，吴建平,4，韦胜，郎侠*，王彩莲*

(1.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省牛羊种质与秸秆饲料化重点实验室，甘肃 兰州 730070； 3.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；4.西北师范大学新农村发展研究院，甘肃 兰州 730070)

反刍动物每年CH4排放量占全球人类活动CH4排放总量的26%[1]。CH4的排放不仅严重污染了大气环境，同时降低了家畜对饲料中能量的利用效率[2]。近年来，人们研究了多种通过调节瘤胃发酵来减少反刍动物甲烷排放的方法，其中天然绿色饲料添加剂是研究的热点之一。大量研究表明，植物精油(essential oil, EO)及其生物活性化合物能够通过调控反刍动物瘤胃发酵来提高饲料能量利用率、降低CH4排放[3]，同时，还可以影响瘤胃的生物氢化作用，调控脂肪酸的合成代谢，提高牛奶和肉类的营养品质[4]。牛至精油(oregano EO)是从牛至(Origanumvulgare)中提取的具有抗菌、抗氧化活性的挥发油，其活性成分主要是香芹酚、百里酚、松油烯和芳樟醇等物质[5]。Busquet等[6]在体外瘤胃发酵试验中发现，添加香芹酚(2.2 mg·L-1)可以降低发酵液中氨氮浓度。另外，绵羊饲粮中添加牛至精油减少甲烷排放量12%[7]。牛至精油还可以维持瘤胃pH稳定，提高干物质消化率，促进犊牛的生长发育[8-9]。牛至精油中的活性成分香芹酚和百里酚能加速胃肠道上皮细胞的更新率，减少病原体对肠道上皮细胞的感染，抑制有害菌的生长[10]。Patra等[11]研究发现，添加不同浓度的牛至精油(250、500和1000 mg·L-1)，随着添加量的增加总产气量、CH4产量、干物质消化率、中性洗涤纤维消化率均显著降低，并影响挥发性脂肪酸的浓度。目前牛至精油在生产实践中的研究较少，并且对牛至精油浓度范围的研究较小，不同的研究对生产实践所提供的最适浓度不同，因此本研究在前人的研究基础上，增加了牛至精油的添加梯度，细化了添加水平的范围，以100、400、700和1000 mg·L-1不同添加水平更进一步研究其对瘤胃体外养分降解率及发酵特性的影响，筛选牛至精油最佳添加量，为其在反刍动物生产中的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供体动物及饲养管理

试验选取3只体况和体重[(56.68±2.14) kg]相近装有永久瘤胃瘘管的健康公羊(德国美利奴×小尾寒羊的杂交1代)作为瘤胃液供体羊。试验羊单栏饲养，饲粮参照国家研究委员会(National Research Council, NRC)(2007)[12]推荐营养需要配制，精粗比为34.5∶65.5，其组成及营养水平见表1。每天分别于8:00和18:00等量饲喂两次，先粗后精，自由饮水。采集瘤胃液进行体外产气试验前供体羊预饲7 d。

表1 试验饲粮组成及营养水平Table1 Composition and nutrient of experimental diet (dry matter basis)

1)每kg预混料含有One kg of premix contained the following: VA220000 IU, VD372000 IU, VE2000 IU, D-生物素D-biotin 40 mg，烟酰胺Nicotinic acid amide 2000 mg, Mn (as manganese sulfate) 710 mg, Zn (as zinc sulfate) 2005 mg, Fe (as ferrous sulfate) 830 mg, Cu (as copper sulfate) 680 mg, Co (as cobalt sulfate) 12 mg。2)消化能为计算值，其他为实测值。Digestive energy were calculated values and others were measured values.

1.2 试验设计

牛至精油购自美国Ralco动物营养公司，牛至精油的主要活性成分为：香芹酚(carvacrol，含量为80%～85%)，百里香酚(thymol，含量为 2.5%～3.0%)，对伞花烃(p-cymene，含量为3.5%～9.0%)，γ-萜品烯 (γ-terpinene，含量为2.0%～5.5%)。试验采用单因素完全随机设计，分为5个处理组，每个处理组4个重复，发酵瓶(250 mL)中分别添加5个不同水平的牛至精油：不添加牛至精油组(CON)，添加100(EO1)、400(EO2)、700(EO3)和1000 mg·L-1(EO4)牛至精油组。另设置一个空白对照(4个重复)，即不添加发酵底物和牛至精油，用于发酵瓶产气量的校正。

1.3 体外发酵及样品采集

于晨饲后2 h通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，用4层纱布过滤，将过滤后的瘤胃液装于提前充满CO2的保温瓶迅速带回实验室，整个操作于39 ℃水浴中进行。体外产气装置采用ANKOM RFS(美国ANKOM technology corporation)全自动记录装置气体测量系统。发酵所用底物与供体动物所喂饲粮一致。将烘干后的饲粮通过高速粉碎机(XFB-200)粉碎约1 mm颗粒，再准确称取约1200 mg饲粮样品投入250 mL发酵瓶中，每个发酵瓶中分别加入相应质量的牛至精油。接种时迅速将每个瓶中加入100 mL预热的人工瘤胃缓冲液和50 mL过滤后的瘤胃液，人工瘤胃缓冲液按Menke等[13]方法配制，并向瓶中持续通入CO230 s后，立即加上瓶塞，并将每个发酵瓶与产气装置的每个传感器相连接，于39 ℃下连续培养48 h，自动记录产气压力。分别在不同发酵时间点(1、3、6、9、12、18、24、36和48 h)利用密封气体进样针采集5 mL发酵瓶顶部气体，用于CH4产量的测定。发酵结束后，将所有发酵瓶在冰水中终止发酵，收集15 mL发酵液测定发酵参数，将剩余发酵液离心收集发酵残渣测定养分含量。

1.4 测定指标及测定方法

1.4.1饲粮养分测定 参照《饲料分析及饲养质量检测技术》[14]测定饲粮和发酵残渣干物质(dry matter,DM)、粗蛋白(crude protein,CP)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)含量。干物质降解率(dry matter degradability，DMD)、粗蛋白降解率(crude protein degradability，CPD)、酸性洗涤纤维降解率(acid detergent fiber degradability，ADFD)、中性洗涤纤维降解率(neutral detergent fiber degradability，NDFD)，根据Tilley等[15]的方法计算。

1.4.2发酵参数及CH4产量测定 用pH 211型精密pH计(HAN-NA)测定发酵液pH值；使用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N浓度[16]；采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)配合WD-2102B型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)测定微生物蛋白(microbial protein，MCP)含量，测定方法按照试剂盒说明书进行；采用气相色谱仪(日本岛津GC-2010 Plus)测定挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)和CH4含量[17]。ANKOM RFS气体测量系统自动记录产气瓶发酵产生的压力，气压可以转化成气体体积，根据理想气体方程，累计产气量可以按以下公式进行计算：

Vx=VjPpsi×0.068004084

式中：Vx为产气总体积(mL)；Vj为发酵瓶顶部空间体积(mL)；Ppsi为气体测量系统自动记录的压力(kPa)。

1.5 数据统计与分析

利用Excel软件进行数据整理，采用SPSS 19.0软件的 One-way ANOVA和GLM进行方差分析。以P<0.05作为差异显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 体外情况下牛至精油对饲料养分降解率的影响

与CON组相比，EO1组DMD显著升高1.81%(P<0.001)，而EO3、EO4组分别显著下降1.65%、2.14%(P<0.001)；EO1组CPD、NDFD分别显著升高2.05%(P=0.032)、1.65%(P=0.009)，而EO4组分别显著降低1.91%(P=0.032)、1.16%(P=0.009)。牛至精油对ADFD无显著影响(P=0.106)(表2)。

表2 牛至精油对体外养分体外降解率的影响Table 2 Effects of oregano EO on nutrient degradability of diet in vitro

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，SEM为平均标准误。下同。

Note: In the same row, values with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letters mean no significant difference (P>0.05). SEM indicates: Mean standard error. The same below.

2.2 牛至精油对体外瘤胃发酵参数的影响

EO1组pH显著低于其他4组(P<0.05)，TVFA、丙酸浓度显著高于其他4组(P<0.05)，丙酸/总挥发性脂肪酸显著高于CON 、EO2和EO4组(P<0.05)；EO1组乙酸浓度显著高于EO2、EO3和EO4(P<0.05)，但乙酸/总挥发性脂肪酸显著低于EO3、EO4组(P<0.05)；与CON相比，添加牛至精油组均显著降低了培养液丁酸、丁酸/总挥发性脂肪酸和NH3-N浓度(P<0.05)，但对MCP浓度无显著影响(P=0.563)(表3)。

2.3 牛至精油对体外发酵总产气量和CH4产量的影响

结果显示，时间对总产气量、CH4产量以及CH4/总产气均有显著效应(P<0.001)，牛至精油添加水平和时间的互作用对CH4产量有显著效应(P<0.05)，但对总产气量和CH4/总产气无显著效应(P>0.05)(表4)。从牛至精油不同添加水平来看，总产气量、CH4产量、CH4/总产气整体呈现降低趋势； EO1组在发酵1、3、9、12 h时总产气量、CH4产量、CH4/总产气均无显著变化(P>0.05)，发酵6、18～48 h时总产气量显著降低(P<0.05)，CH4产量无显著变化，CH4/总产气显著升高(P<0.05)；EO2、EO3组在发酵1 h时，CH4产量、总产气量、CH4/总产气均无显著变化(P>0.05)，发酵3、6、24、48 h时，总产气量、CH4产量显著降低(P<0.05)，CH4/总产气无显著变化(P>0.05)，发酵18、36 h时总产气量、CH4产量、CH4/总产气均显著降低(P<0.05)，发酵12 h时，总产气量无显著变化(P>0.05)，CH4产量、CH4/总产气显著降低(P<0.05)；EO4组在发酵1 h时总产气量、CH4产量、CH4/总产气均无显著变化(P>0.05)，发酵6、12、18、36 h时总产气量、CH4产量、CH4/总产气均显著降低(P<0.05)，发酵3、9、24、48 h时总产气量、CH4产量显著降低(P<0.05)，CH4/总产气无显著变化(P>0.05)。

表3 牛至精油对体外瘤胃发酵参数的影响Table 3 Effects of oregano EO on parameters in vitro fermentation

3 讨论

3.1 牛至精油对饲粮养分体外瘤胃降解率的影响

体外养分降解率不仅能够反映饲料在发酵体系中被微生物的降解程度，还能反映其被动物消化利用的难易程度[18]。关于不同植物精油对体内和体外养分降解率的影响报道不尽相同。体外研究表明，添加5、50 mg·L-1植物精油活性成分(丁子香酚，柠檬烯和百里香酚)对干物质降解率无显著影响[19]，另外，添加250、500和1000 mg·L-1丁香油、桉树油和大蒜油对体外养分消化率无显著影响[11]。而金恩望等[20]研究发现，添加量高于1.0 g·L-1的植物精油(茶树油、肉桂油、丁香油)能抑制饲料底物的降解，而当添加量低于1.0 g·L-1时，对体外干物质降解率无显著影响。本试验结果与其不同，原因可能是不同的植物精油对养分降解率影响的剂量不同。然而也有研究表明牛至油对饲粮养分降解率无显著影响[21]。以上结果表明，由于不同植物精油及其有效化学成分复杂多样，导致其功能特性各异，对体外养分消化率的影响也各不相同。本研究发现，添加100 mg·L-1牛至精油时，养分降解率最高，当牛至精油添加量大于100 mg·L-1时，养分降解率逐渐下降，其原因可能是牛至精油添加量为100 mg·L-1时，可以选择性地促进瘤胃原虫、细菌和真菌的活性，改善瘤胃机能[22]，从而提高饲粮养分降解率，添加量高于100 mg·L-1时，可能对瘤胃微生物活性及瘤胃发酵产生抑制作用，降低饲粮养分降解率。

3.2 牛至精油对体外瘤胃发酵参数的影响

挥发性脂肪酸是饲粮中碳水化合物在瘤胃中降解的主要产物，是反刍动物主要的能量来源以及合成乳脂和体脂的重要原料[23]。瘤胃pH是衡量反刍动物瘤胃内环境稳态的重要指标，主要受饲料性质、唾液分泌量和有机酸积累的影响[24]。徐方华[25]利用瘤胃体外批次培养方法研究发现，牛至油可以提高培养液pH，且与牛至油的添加水平成正比。 另外， 张然等[21]研究表明， 体外培养液中添加牛至油可以显著提高培养液pH，而添加高水平的牛至油(300、400 mg·L-1)显著降低了培养液TVFA浓度和丙酸比例，同时培养液乙酸占TVFA比例和乙酸/丙酸显著升高。本研究发现，低浓度的牛至精油(100 mg·L-1)显著升高了TVFA、丙酸浓度，同时pH显著降低，而高浓度(大于100 mg·L-1)的牛至精油使pH显著升高，这可能是高浓度的牛至精油抑制了瘤胃发酵，使得TVFA和乙酸、丙酸、丁酸浓度显著降低，本研究中养分降解率变化与此相一致。另外本研究中乙酸占TVFA的比例在高浓度(大于100 mg·L-1)条件下显著升高，而丙酸、丁酸占TVFA的比例显著降低，这些结果表明高浓度的牛至精油会使瘤胃更加趋向于乙酸发酵。林波[26]研究发现，在体外培养液中添加高浓度牛至油(500、750 mg·L-1)，能够破坏瘤胃壁细胞膜的完整性，影响瘤胃的健康发育，从而抑制瘤胃发酵。Patra等[27]试验表明，体外培养液中添加牛至油会减少瘤胃原虫、细菌和主要纤维素分解菌(产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)的数量，且与牛至油的添加水平呈线性关系。结合本试验结果，可以推断高浓度(大于100 mg·L-1)牛至精油可能通过影响微生物活性，降低TVFA浓度，抑制瘤胃发酵。

表4 牛至精油对体外发酵总产气量和CH4产量的影响Table 4 Effects of oregano EO on total gas production and CH4 production in vitro fermentation

注：Tre表示不同梯度牛至精油，T表示发酵时间。

Note: Tre indicates different concentrations of oregano essential oil, T indicates fermentation times.

NH3-N浓度是饲粮含氮物质在瘤胃内降解及微生物对氨利用的综合反映[28]。NH3-N浓度作为评价瘤胃中氮存留率的重要指标，其降低意味着瘤胃中蛋白降解率的降低或者瘤胃微生物对NH3-N利用率的提高。大量体外试验表明，植物精油能够抑制瘤胃NH3的产生，提高氮的利用率。Wang等[7]研究表明，给绵羊连续饲喂15 d添加250 mg·d-1牛至油预混剂的饲粮后，绵羊瘤胃液氨氮浓度显著降低。Noorian等[29]研究发现，植物精油可以降低NH3-N浓度，并且可以减少原虫的数量。本试验结果表明，添加牛至精油NH3-N浓度显著降低，而牛至精油对MCP浓度无显著影响，可能是牛至精油能够抑制瘤胃产氨菌的生长，降低脱氨酶活性，使得氨基酸脱氨基作用降低[30]，同时生成的TVFA和NH3-N降低，也可能会抑制瘤胃液原虫数量，降低NH3-N浓度[31]。另外，由于发酵处于密闭的发酵瓶内，发酵48 h后发酵底物不断被消耗，微生物总数以及活性基本处于稳定状态，因此MCP浓度无显著差异。

3.3 牛至精油对体外瘤胃发酵总产气量和CH4产量的影响

总产气量是反映饲料可发酵程度及瘤胃微生物活性的重要指标[31]。目前，植物精油对反刍动物总产气量的相关报道较少。反刍动物瘤胃内合成CH4的主要途径是氢气还原二氧化碳形成甲烷，其次是乙酸、甲酸和丁酸等挥发性脂肪酸合成CH4[32]。张然等[21]研究表明，牛至油能调控瘤胃发酵和降低甲烷产量，但添加高水平(300、400 mg·L-1)的牛至油对绵羊瘤胃发酵具有抑制作用。Chaudhary等[33]研究表明，添加450 mg·L-1的百里香油和牛至油能显著降低体外发酵CH4产量，而50、150 mg·L-1的添加水平对CH4产量没有显著影响。Oskoueian等[34]认为，植物精油在降低CH4产量的同时伴随着对瘤胃微生物发酵的抑制，这种改变与植物精油的种类和剂量以及所采用的底物有关。Patra等[11]对5种植物精油(丁香油、桉树油、大蒜油、起酥油、和薄荷油)在体外发酵试验中发现，1 g·L-1大蒜油对CH4产生抑制最显著，表明植物精油对CH4产量降低的效果与植物精油的种类和剂量有关。本研究发现，发酵时间对总产气、CH4产量以及CH4比例均具有显著效应，而发酵时间和处理的互作效应主要表现在对CH4产量的影响上，对总产气和CH4占总产气比例互作效应不显著。在发酵1～12 h，添加100 mg·L-1的牛至精油对总产气量、CH4产量无显著影响，发酵18～48 h，由于碳水化合物的减少，可能会导致发酵产生的CO2等其他气体相应降低，使得总产气量降低，而CH4可能会通过累积的VFA以及甲醇等途径合成[35]，因此CH4产量无显著变化，当添加量高于100 mg·L-1时，从整体看，牛至精油对总产气量、CH4产量均有抑制作用，尤其对发酵18、36 h时CH4产量的抑制作用大于对总产气量的抑制作用，这可能与瘤胃发酵气体的产生机制有关，高剂量的牛至精油一方面抑制了产CH4菌的生长[36]并改变了古细菌群落结构，从而减少了CH4产量[37]，另一方面，可能抑制微生物对碳水化合物的利用，抑制瘤胃发酵，本研究TVFA降低的结果与此一致，总产气量下降的同时CH4产量也相应降低，最终使得CH4产量在总产气量中的比例显著下降。

4 结论

1)添加100 mg·L-1牛至精油可提高DMD、CPD、NDFD，添加量大于100 mg·L-1时养分降解率逐渐降低。

2)牛至精油可降低培养液丁酸和NH3-N浓度，添加100 mg·L-1牛至精油可提高培养液TVFA、乙酸和丙酸浓度，而添加量大于100 mg·L-1牛至精油降低培养液TVFA、乙酸和丙酸浓度，对瘤胃发酵产生抑制作用。

3) 添加100 mg·L-1牛至精油可降低发酵18 h后总产气量，但对CH4产量无显著影响，添加量高于100 mg·L-1时，可以降低总产气量和CH4产量。

综合认为，在绵羊瘤胃体外发酵条件下，牛至精油添加量不应高于100 mg·L-1。